科研 | PLANT CELL：转录因子NIGT1.2在磷酸盐饥饿条件下能够调节拟南芥和玉米的磷酸盐摄取及硝酸盐内流（国人佳作）

编译：艾奥里亚，编辑：景行、江舜尧。

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导读

在磷和氮是植物生长和作物生产所必需的常量营养素。在磷饥饿条件下，植物提高了对磷酸盐（Pi）的吸收能力，但降低了对硝酸盐（NO₃^-）的吸收能力，但其中的机制目前尚不清楚。本研究发现GARP型转录因子NITRATE-INDUCIBLE，GARP-TYPE TRANSCRIPTIOANL REPRESSOR1.2 （NIGT1.2）在Pi饥饿时能够同时对Pi和NO₃^-的吸收起到调控作用。NIGT1.2的过表达提高了拟南芥（Arabidopsis thaliana）对磷的吸收能力，但降低了对NO₃^-的吸收能力。此外，nigt1.1 nigt1.2双突变体在低磷胁迫下表现出对Pi的吸收降低，而对NO₃^-的吸收增加的现象。在Pi饥饿过程中，NIGT1.2通过与其启动子中的顺式作用元件（cis-element）结合，直接上调了Pi的转运基因PHOSPHATE TRANSPORTER 1;1 （PHT1;1）和PHOSPHATE TRANSPORTER 1;4 （PHT1;4），同时下调NO₃^-的转运基因NITRATE TRANSPORTER 1.1 （NRT1.1）。进一步通过遗传分析表明，PHT1;1、PHT1;4以及NRT1.1对NIGT1.2具有遗传上位性。此外，在玉米（Zea Mays）中发现了类似的调控途径。这些数据表明，转录因子NIGT1.2在调节低磷依赖的Pi和NO₃^-的吸收中起着关键作用。

论文ID

原名：The Transcription Factor NIGT1.2 Modulates Both Phosphate Uptake and Nitrate Influx during Phosphate Starvation in Arabidopsis and Maize

译名：转录因子NIGT1.2在磷酸盐饥饿条件下能够调节拟南芥和玉米的磷酸盐摄取及硝酸盐内流

期刊：Plant Cell

IF：9.618

发表时间：2020年11月

通讯作者：陈益芳

通讯作者单位：中国农业大学

DOI号：10.1105/tpc.20.00361

实验设计

本研究以Col-0生态型拟南芥作为野生型拟南芥。分别基于GK_122B12、SALK_137632和SALK_070096制备出nigt1.2-1、nigt1.2-2和nigt1.2-3突变体。为了构建35S:NIGT1.2，研究者用基因特异性引物PCR扩增出的NIGT1.2编码序列克隆到pCXSN载体中。将NIGT1.1中的一对sgRNA靶标（M1：ATAATGATGATGATGTCAAGAGCGG；M2：AGCTATCGAGTCATGTCGGAAGG）克隆到pHEE2A-tri载体中，并转化到野生型拟南芥和nigt1.2-1中，分别获得nigt1.1突变体和nigt1.1 nigt1.2双突变体。

拟南芥种子在4 °C层积72h后，分别在Murashige和Skoog（MS）培养基上生长，每日光照周期为16h（光照强度为100µmol/m²s）。通过对MS培养基组分进行修正，使其Pi浓度为10µM，并用琼脂（agar）代替琼脂（agarose，Promega），我们制备了LP培养基。在拟南芥水培条件下，幼苗生长在不添加蔗糖的1/4 MS营养液中生长。在玉米水培条件下，将9日龄无胚乳的玉米幼苗转移到含有或不含有250µM KH₂PO₄的1/8 Hoagland营养液中，并在28 °C、14h日光周期（光强350µmol/m²s）下生长。

结果

1    拟南芥在Pi饥饿条件下增强了Pi的吸收同时降低了对NO₃^-的摄取

土壤溶液中Pi的浓度通常低于10 µM，导致磷缺乏的现象时常发生，而Pi和NO₃^-之间又存在着拮抗作用。在此背景下，研究探究了低Pi胁迫条件下，Pi和NO₃^-吸收之间的相互作用关系。实验中发现，相对于含有Pi（+P）的培养液种植的幼苗而言，不含Pi（-P）培养的幼苗的生长显著受到Pi缺乏的抑制（图1A），但其Pi的吸收速率显著增加（图1B）。与此同时，在Pi缺乏条件下，该组幼苗中N的浓度（图1C）、硝酸盐浓度（图1D）以及硝酸盐的摄取速率也显著降低（图1E）。

拟南芥吸收NO₃^-的分子机制可归属于两种NO₃^-的吸收体系：高亲和力体系和低亲和力体系。其中，NRT1.2（低亲和力的NO₃^-转运蛋白）和NRT1.1（双亲和力的NO₃^-转运蛋白）在硝酸盐富集条件下参与了NO₃^-的吸收。NRT2家族成员，NRT2.1和NRT2.4，参与高亲和力的NO₃^-摄取。基于对NRT1s和NRT2s的测定，研究者发现，NRT1.1的转录受到低Pi胁迫的显著抑制，而NRT1.2、NRT2.1以及NRT2.4的转录并不受低Pi胁迫的调节（图1F），这表明Pi缺乏通过下调NRT1.1的表达来抑制拟南芥对NO₃^-的吸收。

图1. 缺乏Pi可增强拟南芥对磷酸盐的吸收，抑制硝酸盐的吸收。A代表不同幼苗生长表型；B代表以³²P标记所测定的不同幼苗对Pi的吸收能力；C-E代表分别代表不同幼苗N浓度（C）、硝酸盐浓度（D）以及N内流速率（E）；F代表基于RT-qPCR分析了NRT1s和NRT2s的表达情况。

2   在Pi饥饿期间，NIGT1.2正向调节Pi的摄取

PHT1;1和PHT1;4作为拟南芥根部磷吸收过程中的主要Pi转运蛋白。有研究发现，在Pi饥饿期间，PHT1;1和PHT1;4的转录有所上调，但本研究中NRT1.1的表达受到抑制（图1F）。为了筛选直接调控PHT1;1或NRT1.1表达的转录因子，研究者利用PHT1;1和NRT1.1的启动子在高通量拟南芥转录因子筛选系统中进行了酵母单杂交试验。无论是采用PHT1;1启动子还是NRT1.1启动子，均分离得到了At1g68670（或称为HHO2或NIGT1.2），这表明NIGT1.2直接调控PHT1;1和NRT1.1的表达。作为一种转录因子，NIGT1.2蛋白仅定位于细胞核中。与之前的研究结果相似，研究者同样发现了Pi的缺乏和NO₃^-处理能够诱导NIGT1.2的转录。而GUS染色进一步证实NIGT1.2的转录在低Pi胁迫下上调（图2A）。

鉴于Pi饥饿条件下诱导了NIGT1.2的表达（图2A），通过培育NIGT1.2过表达的拟南芥品系用于进一步研究（35S:NIGT1.2-8和35S:NIGT1.2-23，图2B）。这两个品系的幼苗的Pi浓度均高于野生型幼苗，这与它们NIGT1.2的表达水平一致（图2C），这些结果表明，NIGT1.2的过表达增加了拟南芥中Pi的浓度。随后，研究者在含有³²P标记的500 µM的Pi补充液中，测定了10日龄幼苗在6小时内Pi的吸收速率。与野生型植株相比，NIGT1.2高表达的植株对Pi的吸收能力显著增强，且这种增加与NIGT1.2表达水平密切相关（图2D）。这些数据表明，NIGT1.2的过表达促进了拟南芥对Pi的吸收。

基于三种不同的NIGT1.2突变体（nigt1.2-1、nigt1.2-2和nigt1.2-3），研究者进一步探究了NIGT1.2的功能。基于RT-qPCR结果，发现，在3个nigt1.2突变体中，NIGT1.2的转录有所下调；对于Pi的浓度而言，无论是在Pi富集还是在Pi饥饿条件下，nigt1.2突变体中Pi浓度与野生型植株相似。

NIGT1.1/HHO3是拟南芥基因组中NIGT1.2的同源基因，NIGT1.1同样也受到低Pi的胁迫和NO₃^-的诱导。基于CRISPR/Cas9技术，分别制备了nigt1.1突变体和nigt1.1 nigt1.2双突变体。其中，nigt1.1突变体在低磷胁迫下表现出与nigt1.2突变体和野生型植株相似的表型（图2E），同时表现出与野生型植株相似的磷浓度和磷吸收速率（图2F和2G）。但nigt1.1 nigt1.2双突变体在缺磷条件下表现为低磷敏感表型，其磷浓度和磷吸收能力显著低于野生型植株；而在磷充足条件下，nigt1.1 nigt1.2双突变体与野生型植株在磷浓度或磷吸收方面没有明显差异（图2F和2G）。基于以上数据研究者发现，NIGT1.2在Pi饥饿期间正向调节Pi的吸收。

图2. 在Pi饥饿条件下，NIGT1.2正向调节了拟南芥对Pi的获取。A代表ProNIGT1.2：GUS转基因株系的GUS染色试验；B代表不同植株的NIGT1.2表达情况； C-D分别代表不同植株Pi浓度和Pi吸收速率；E代表不同品系植株表型比较；F-G分别代表在不同Pi浓度培养条件下不同植株中Pi浓度和Pi的吸收速率。

3   在Pi饥饿期间，NIGT1.2直接上调了Pi转运基因

NIGT1.2调节了Pi的摄入以响应环境中Pi的供给（图2），而在低磷和高磷环境中，PHT1;1和PHT1;4是根中磷吸收的主要转运蛋白。因此研究者猜想，NIGT1.2通过直接调节PHT1;1和PHT1;4的表达来调节Pi的摄入。基于RT-qPCR分析发现，在NIGT1.2过表达的品系中，PHT1;1和PHT1;4的转录水平都有所增加，这与NIGT1.2的表达水平相一致（图3A）。此外，当将ProPHT1;1:GUS转基因品系与野生型植株和NIGT1.2过表达品系（35S:NIGT1.2-23）杂交时，在NIGT1.2过表达品系中GUS的染色增强（图3B），这表明NIGT1.2正调控了PHT1;1的转录。研究者还对nigt1.1 nigt1.2双突变体中PHT1;1和PHT1;4的表达进行了测定，在Pi充足条件下，双突变体植株和野生植株无显著差异；但在低Pi胁迫条件下，野生型植株中PHT1;1和PHT1;4的转录显著增强，但却在nigt1.1 nigt1.2双突变体中被抑制（图3C和3D），这表明NIGT1.2正向调节了低Pi胁迫下的PHT1;1和PHT1;4的转录表达。

以往的报道表明，转录因子HYPERSENSITIVITY TO LOW PI-ELICITED PRIMARY ROOT SHORTENING 1（HRS1，NIGT1.2的同源基因）可以与上调元件AGANNNAAA和AAACNNAACC相互结合。cis-element分析表明，PHT1;1和PHT1;4的启动子分别含有两个上调 up-regulatory cis-motifs（AGANNNAAA和AAACNNAACC）和一个 up-regulatory cis-motifs（AGANNNAAA）（图3e）。随后基于染色质免疫共沉淀（ChIP），进一步证实了NIGT1.2能够与植物中PHT1;1和PHT1;4的启动子结合。在MS或LP培养基中分别培养7日龄野生自主幼苗5d后，收集其根部并采用抗NIGT1.2抗体进行ChIP检测（图3F），研究者发现，在低Pi胁迫下生长的植物中，抗NIGT1.2抗体主要富集在PHT1;1启动子的P2端；而在Pi充足的条件下，PHT1;1启动子的P1或P2端均未检测到NIGT1.2的富集（图3G）。此外，在PHT1;4启动子中发现了相似的规律：在Pi饥饿时NIGT1.2可以与PHT1;4启动子的P1端结合（图3H）。这些数据表明，NIGT1.2在Pi缺乏条件下与PHT1;1和PHT1;4的启动子结合，这与Pi饥饿条件下，在nigt1.1 nigt1.2双突变体中PHT1;1和PHT1;4的表达变化相一致。

基于EMSA凝胶迁移（Electrophoretic mobility shift assay），进一步测定了NIGT1.2是否能与PHT1;1和PHT1;4启动子中的cis-elements相结合。NIGT1.2重组蛋白使PHT1;1启动子P2端的P2-1 probe上移，但当P2-1探针中的cis-elements从AAACATAACC突变为AAACATAATT时，这种上移几乎被取消（图3I）。NIGT1.2重组蛋白还能够与PHT1;4启动子的P1-1 probe结合（图3J），当PHT1;4启动子P1-1中的cis-elements AGAAACAAA突变时，NIGT1.2-mP1-1复合体的上移信号被抑制（图3J）。这些数据表明，NIGT1.2在体外和体内都能与PHT1;1和PHT1;4的启动子结合。

为了进一步测试NIGT1.2在PHT1;1和PHT1;4表达调控中的作用，研究者在Nicotiana benthamiana叶片中进行了瞬时表达实验，发现了NIGT1.2能够上调PHT1;1和PHT1;4启动子的活性（图3K和3L）。

图3. NIGT1.2直接调节PHT1;1和PHT1;4的转录以响应低Pi的胁迫。A代表PHT1;1和PHT1;4在NIGT1.2过表达植株和野生植株在MS培养基中的表达情况；B代表GUS染色显示PHT1;1在NIGT1.2过表达植株和野生型植物的根中；C-D分别代表PHT1;1和PHT1;4在双突变体和野生型植株中的表达情况；E显示了顺式调节元件（蓝线）的相对位置；F代表NIGT1.2过表达植株，双突变体植株以及野生植株中NIGT1,2表达的蛋白质印迹分析；G-H代表 NIGT1.2体外结合PHT1;1和PHT1;4的ChIP-qPCR分析；I-J代表重组NIGT1.2结合PHT1;1和PHT1;4启动子的EMSA分析；K-L代表N. benthamiana中NIGT1.2的瞬时过表达。

4   在Pi饥饿过程中，NIGT1.2抑制了NO₃^-的摄取

同样对NIGT1.2过表达品系和nigt1.1 nigt1.2双突变体在不同Pi条件下的N相关生理参数进行了测定。NIGT1.2过表达植株中氮的浓度低于野生型植株（图4A）。在磷充足的条件下，nigt1.1 nigt1.2双突变体中氮的浓度与野生型植株之间无明显差异，但在缺磷条件下显著增加（图4B）。而无论是在缺磷还是在磷充足条件下，nigt1.2-1或nigt1.1单突变体的氮浓度与野生植株相似（图4B）。就NO₃^-的流入而言，与野生型植株相比，NIGT1.2过表达品系在Pi充足条件下表现出NO₃^-内流的减少，而这种降低与NIGT1.2表达水平呈负相关（图4C）。nigt1.1 nigt1.2双突变体在Pi充足条件下对野生型植株的NO₃^-内流没有影响，但在Pi缺乏条件下显著增加了NO₃^-内流（图4D）。这些数据表明，NIGT1.2在低磷胁迫下抑制NO₃^-内流。

图4. 在低Pi胁迫下，NIGT1.2减少拟南芥硝酸盐的内流。A代表NIGT1.2过表达植株中N浓度测定；B代表nigt1.2-1，nigt1.1以及nigt1.1 nigt1.2双突变体中N的浓度；C代表NIGT1.2过表达植株和野生植株中¹⁵NO₃^-内流情况；D代表nigt1.2-1，nigt1.1，nigt1.1 nigt1.2上突变体和野生植株在不同Pi浓度培养基中中的 ¹⁵NO₃^-内流情况。

5   在Pi饥饿期间，NIGT1.2直接下调了NRT1.1 

对NIGT1.2过表达品系和nigt1.1 nigt1.2双突变体中NRT1.1的表达进行了测定发现，NRT1.1的转录在NIGT1.2过表达品系中受到抑制，其抑制程度与NIGT1.2的表达水平相一致（图5A）。此外，基于ProNRT1.1:GUS转基因品系与野生型株和35S:NIGT1.2-23杂交，并通过GUS染色我们发现，NIGT1.2抑制了NRT1.1启动子的活性（图5B）。在Pi充足条件下，nigt1.1 nigt1.2双突变体和野生型植株之间就NRT1.1表达而言无显著差异（图5C）。但在Pi饥饿条件下，野生型植物中NRT1.1的转录受到显著抑制，而这种抑制作用在nigt1.1 nigt1.2双突变体中要小得多（图5C），这说明NIGT1.2在低Pi胁迫下下调了NRT1.1的转录。无论是在缺磷和磷充足条件下，nigt1.1 nigt1.2双突变体和野生型植株之间就NRT2.4的表达而言无显著差异（图5C）。

基于对NRT1.1启动子结构的分析（图5D），研究者假设NIGT1.2通过与其启动子结合而下调NRT1.1的表达。因此，在Pi胁迫与否的条件下对7日龄的野生型幼苗的根部进行了ChIP检测。其中，在Pi充足条件下，在NRT1.1启动子P1-P5片段中并没有检测到NIGT1.2的富集现象；相反，在Pi胁迫条件下，抗NIGT1.2抗体显富集在NRT1.1启动子的P5、P4和P3片段上（图5E），这表明NIGT1.2可以在低PI胁迫下与NRT1.1启动子结合。进一步通过EMSA实验，我们发现重组NIGT1.2蛋白导致P5-1、P4-1、P3-1和P3-2 probes上移，这其中每个probes都含有一个cis-element，而当这些顺式元件发生突变时，这种上移几乎被取消（图5F）。这些数据表明，NIGT1.2在体外和体内都能与NRT1.1启动子结合。

为了进一步证实NIGT1.2直接调控NRT1.1的表达，将ProNRT1.1:GUS和35S:NIGT1.2在N. benthamiana叶片中共表达。与仅表达ProNRT1.1:GUS的植物相比，NIGT1.2显著抑制了NRT1.1启动子的活性（图5G）。

图5. 在低Pi胁迫下，NIGT1.2直接下调NRT1.1的表达。A代表NIGT1.2过表达植株和野生植株在MS培养基中NRT1.1的表达情况；B代表NIGT1.2过表达植株和野生植株在MS培养基中NRT1.1表达模式的GUS染色；C代表双突变体和野生植株在不同培养基中的NRT1.1和NRT2.4的表达情况；D代表NRT1.1启动子中cis-element（蓝线）的相对位置；E代表NIGT1.2在体外结合NRT1.1的 ChIP-qPCR分析；F代表重组NIGT1.2体外结合NRT1.1启动子的EMSA分析；G代表N. benthamiana中NIGT1.2的瞬时过表达。

6    NIGT1.2与PHT1s或NRT1.1之间的调控关系

与野生型植株相比，NIGT1.2过表达植株增加了对Pi的吸收（图2），与此同时NIGT1.2正向调节PHT1;1和PHT1;4的转录（图3）。有研究发现，与野生型植物相比，归属于Wassilewski ja（Ws）生态型的pht1;1△4△双突变体，对磷的吸收能力降低了75%。为了探究NIGT1.2与PHT1;1/PHT1;4之间的调控关系，我们通过在pht1;1△4△双重突变体中过表达NIGT1.2，产生了pht1;1△4△ 35S:NIGT1.2系（图6A-B）。与野生型植株（WT-Col）相比，NIGT1.2过表达品系（35S:NIGT1.2-8）对磷的吸收能力以及植株内磷浓度都有所增加，而pht1;1△4d△35S:NIGT1.2转基因品系对磷的吸收能力和植株内磷浓度都表现出降低的现象，这种降低与pht1;1△4△双突变体相似（图6C-D），这表明PHT1;1和PHT1;4在遗传上对NIGT1.2具有上位调控的作用。

图6. pht1;1△4△35s:nigt1.2转基因株系与pht1;1△4△双突变体具有相似的Pi摄取能力。A代表pht1;1△4△35s:nigt1.2转基因株系中NIGT1.2和PHT1;4的表达情况；B代表pht1;1△4△35s:nigt1.2转基因株系中PHT1;1的表达情况；C代表不同品系基因型的Pi摄取能力；D代表转移到MS培养基后5d的Pi摄取能力。

分子和生化分析表明，NIGT1.1/1.2在低Pi胁迫下下调了NRT1.1的表达，与此同时，nigt1.1 1.2双突变体表现出比野生型植株更高的NO₃^-吸收速率和NRT1.1的表达水平（图4和图5）。随后，将nigt1.1 nigt1.2双重突变体与chl1-9突变体杂交，产生了nigt1.1 nigt1.2 chl1-9三重突变体（图7A），该突变体在NRT1.1中有一个Leu取代了Pro492的点突变，并且在NO₃^-摄取方面都存在缺陷。与Pi充足条件下相比，野生型植株对NO₃^-的吸收在低Pi胁迫下显著降低，而chl1-9突变体在Pi胁迫条件下对NO₃^-的吸收仅表现出略微降低的现象（图7B），这表明NRT1.1是响应Pi胁迫的核心NO₃^-转运蛋白。无论是Pi充足与否，nigt1.1 nigt1.2双重突变体中NRT1.1受损将导致NO₃^-吸收的降低，这一现象与我们在chl1-9突变体中所观察到的相似（图7B）。这些数据表明，NIGT1.1/1.2通过下调NRT1.1的表达来调节依赖低Pi条件下的NO₃^-吸收。

图7. NIGT1.1 NIGT1.2chl1-9三重突变体表现出与chl1-9突变体相似的硝酸盐内流能力。A代表三突变体变化情况；B代表在不同培养基中三突变体的¹⁵NO₃^-的内流情况。

此外，研究者还在P和N共存条件下对nigt1.1 nigt1.2双突变体的表型进行了测定。与野生型幼苗相比，nigt1.1 nigt1.2双突变体在-P+N条件下对低磷胁迫反应敏感，其叶片中存在花青素积累的现象；而在+P-N条件下生长时，nigt1.1 nigt1.2双突变体表现为叶片黄化的缺氮表型，这与野生型幼苗相似；而在-P-N条件下生长时，nigt1.1 nigt1.2双突变体和野生型幼苗均表现缺N表型（图8A）。在氮磷组合条件下，nigt1.1 nigt1.2双突变体的生物量与野生型相似（图8B）。在转录水平上，低磷胁迫（-P+N vs+P+N；-P-N vs+P-N）所诱导的NIGT1.1和NIGT1.2的表达与NO₃^-添加与否无关（图8C），而PHT1;1和PHT1;4的转录在低Pi胁迫（-P+N vs +P+N；-P-N vs +P-N）的诱导下显著增加，但在nigt1.1 nigt1.2双突变体中这种增加受到抑制（图8D-E）。与+P+N条件相比，在-P+N条件下的野生型植株和nigt1.1 nigt1.2双突变体中NRT1.1的表达量下降，但这种下降幅度在双突变体中有所减弱（图8F），但我们在-P-N条件下并没有观察到这种抑制NRT1.1表达的现象（图8F），这些数据表明NRT1.1的转录调控表现出NO₃^-依赖性。

图8. NIGT1.1和NIGT1.2调控了NRT1.1和PHT1s的转录以响应N和P的共存。A代表双突变体在N和P共存条件下的表型；B代表双突变体和野生植株的生物量测定；C代表；C代表在N和P共存条件下NIGT1.2和NIGT1.1的表达情况；D-F代表双突变体和野生植株在N和P共存的培养条件下PHT1;1（D），PHT1;4（E）和NRT1.1（F）的表达情况。

7    低Pi胁迫下NIGT1.2调控基因的鉴定

基于对野生植株和NIGT1.2过表达植株（OE23）的根部进行RNA测序（RNA-seq），研究者探究了NIGT1.2在Pi饥饿过程中对全基因组转录的调控作用。在P ≤ 0.05水平上，发现了与低Pi胁迫相关的差异表达基因（DEG），即在野生型植物的Pi充足组（标准MS培养基）和Pi缺乏组（LP）之间存在差异表达。在Pi饥饿条件下，研究者在野生植株的根部坚定过了3130个上调基因和2490个下调基因，这其中2179个上调的基因（69.6%）和1920个下调的基因（77.1%）受NIGT1.2过表达的调控（图9A）。

在低Pi胁迫下NIGT1.2调控的DEG中，多个基因与多种关键的细胞和代谢功能相关（图9B）。41个转运蛋白基因在低Pi胁迫下由NIGT1.2调节，其中24个下调，17个上调（图9C-D）。这41个转运蛋白基因编码Pi转运蛋白、NO₃^-转运蛋白、氨基酸转运蛋白、钙转运蛋白、糖转运蛋白和多肽转运蛋白等（图9C-D），这些转运蛋白的表达表明，NIGT1.2在Pi饥饿过程中调控了跨膜运输。基于对启动子序列分析发现，所有24个下调的转运蛋白基因在约1500 bp的启动子中都含有两个或三个下调的cis-elements（图9C），而所有17个上调的转运蛋白基因在约1500 bp的启动子处都含有一到两个上调的cis-elements（图9D），这表明NIGT1.2可能直接参与了这些转运蛋白基因的转录过程。

除此之外，由Pi胁迫和NIGT1.2调控所富集的功能基因包括NO₃^-和氨基酸转运蛋白、氮代谢、碳水化合物代谢和信号转导等类别（图9B）。基于RT-qPCR数据发现，包括上述功能基因在内的N相关编码基因在转录水平上受低Pi胁迫和NIGT1.2的调控，这表明NIGT1.2在调节低Pi偶联的NO₃^-反应中起重要作用。低Pi胁迫诱导了NIGT1.2、NIGT1.1、HRS1/NIGT1.4和NIGT1.3同系物的转录（图9F），这与之前的研究相一致。此外，在NIGT1.2过表达的品系中，这些基因的表达都明显受到抑制（图9F）。

图9. NIGT1.2靶基因的鉴定。A以Venn图形式表示了受低Pi胁迫的幼苗，NIGT1.2过表达幼苗以及野生幼苗在MS和LP培养基中基因诱导表达情况；B代表低Pi胁迫和NIGT1.2调控基因的MapMan功能类别；C-D代表同时受低Pi胁迫和NIGT1.2调控的转运蛋白基因的系统聚类分析；E代表编码不同类别蛋白质的N相关基因的RT-qPCR分析；F代表在转移到MS或LP培养基中培养5天后，三种NIGT1.2同源基因（NIGT1.1，NIGT1.4和NIGT1.3）在7日龄OE23和野生型幼苗中的基因表达情况。

8    Pi缺乏抑制了玉米对NO₃^-的摄取

玉米（Zea Mays），一种主要在土壤中种植的重要作物，而土壤中的NO₃^-往往是可用于其生长的氮素的主要来源。9日龄的玉米杂交系B73植株在Pi存在与否的水培条件下培养11d后，其生长受到磷缺乏的抑制（图10A-B）。与磷充足条件下相比，磷缺乏条件下玉米的磷浓度要低得多（图10C）；与在拟南芥中观察到的结果相似，在磷缺乏条件下生长的玉米中氮的浓度也显著降低（图10D）。在缺磷条件下，玉米的NO₃^-内流也减少了（图10E），表明缺磷限制了玉米对NO₃^-的吸收。

玉米B73中有79个硝酸盐转运蛋白家族成员，其中的8个属于NPF6亚家族，命名为ZmNPF6.1-ZmNPF6.8（图10F），这其中的两个NPF6基因，ZmNPF6.4和ZmNPF6.6，在根中的表达相对较高（图10G），而他们的蛋白产物ZmNPF6.4和ZmNPF6.6都是拟南芥NRT1.1的同系物（图10F），具有NO₃^-转运蛋白的功能。由于在磷缺乏条件下玉米对NO₃^-的吸收减少（图10E），研究者对ZmNPF6.4和ZmNPF6.6在磷缺乏条件下的转录情况进行了测定。发现，玉米在Pi饥饿条件下，ZmNPF6.4和ZmNPF6.6的转录均受到抑制（图10H-I）。在ZmNPF6.4和ZmNPF6.6的启动子中存在几个下调的cis-elements（AANNAGA），表明ZmNPF6.4和ZmNPF6.6受玉米转录因子AtNIGT1.2同源基因的转录调控。

玉米基因组中含有AtNIGT1.2的两个同源基因，分别命名为ZmNIGT1.1（Zm00001d023402）和ZmNIGT1.2（Zm00001d023411），这两个基因的编码序列有94.8%的同源性。在Pi缺乏条件下，这两个基因的转录都在玉米根中被诱导（图10J）。此外，ZmNIGT1.2在N.benthamiana的瞬时表达过程中还抑制了ZmNPF6.6启动子的活性（图10K），这表明ZmNIGT1.2下调了ZmNPF6.6的转录。

图10. Pi缺乏抑制了玉米中硝酸盐的内流。A代表生长于不同培养基条件下植株的表型比较；B-D分别代表了玉米B73在不同P浓度下的生物量（B），磷浓度（C）以及氮浓度（D）；E代表B73转移到含有5 mM NO₃^-的不同P浓度的培养基中的硝酸盐含量；F代表系统发育树分析；G代表玉米硝酸盐转运基因NPFs在幼苗（S）和根部（R）的表达情况；H-I分别代表玉米B73幼苗在+P和-P的溶液中培养5天后ZmNPF6.4(H)和ZmNPF6.6(I)的表达情况；J代表在Pi饥饿条件下玉米B73根部ZmNIGT1.1/1.2的RT-qRCP分析；K代表N. benthamiana中ZmNIGT1.2的瞬时表达情况。

讨论

本研究发现了一个依赖于NIGT1.2和NIGT1.1的调控通路，介导了低Pi胁迫下植物对Pi和NO₃^-吸收之间的拮抗串扰。基于这些发现，提出如图11所示的调控模型。

图11. 植物调节磷酸盐和硝酸盐摄取的NIGT1.1/1.2-PHT1s/NRTs调控途径模型。

NIGT1.2作为定位于细胞核中的转录因子（在Pi缺乏条件下被诱导），其转录受核心转录因子PHR1的调节。NIGT1.2的过表达增强了拟南芥对Pi的吸收能力（图2），但降低了对NO₃^-的吸收能力（图4），nigt1.1 nigt1.2双突变体在低Pi胁迫下表现出对Pi的吸收能力下降但增加了NO₃^-的吸收（图2和4），这表明NIGT1.2调节了Pi胁迫期间植物对Pi和NO₃^-的吸收。在拟南芥中，PHT1;1和PHT1;4无论Pi缺乏与否的条件下都是Pi的主要转运体，而NRT1.1作为一个重要的双亲性NO₃^-转运体参与了NO₃^-吸收的多个阶段。Pi胁迫诱导了PHT1;1和PHT1;4的转录（图3C-D），但抑制了NRT1.1的表达（图1F）。EMSA和ChIP分析表明，在低Pi胁迫下，NIGT1.2直接与PHT1;1，PHT1;4和NRT1.1的启动子结合。RT-qPCR结果表明，在低Pi胁迫条件下，NIGT1.2上调PHT1;1，PHT1;4的转录，而下调NRT1.1的转录（图3和图5），说明NIGT1.2通过直接调节PHT1;1，PHT1;4和NRT1.1的转录介导了Pi和NO₃^-的拮抗吸收。

先前的研究发现，除了N饥饿响应基因外，NIGT1还调节SPX DOMAIN基因（SPXs）和PHOSPHATE 2 （PHO2）的表达（编码了主要的调节因子以响应Pi的缺乏）。与野生型拟南芥相比，在氮充足条件下，SPX1、SPX4和PHO2的转录在NIGT1.2ox品系中升高，而在N饥饿条件下，NIGT1.2ox品系中SPX1、SPX4和PHO2的转录水平降低。本研究同样发现SPX1和SPX4在nigt1.1 nigt1.2双突变体中的表达与野生型植株在磷充足或缺磷条件下的表达相似：在磷充足条件下，nigt1.1 nigt1.2双突变体的PHO2表达略低于野生型植株，而在缺磷条件下nigt1.1 nigt1.2双突变体与野生型植株的PHO2表达相似（补充图5C）。这些数据表明，NIGT1.1/1.2调节了SPXs和PHO2的转录以响应N的胁迫，同时在较小程度上响应了P的胁迫。

除了对拟南芥的研究之外，研究者探究了在低磷胁迫下玉米对NO₃^-的吸收情况。与之前的而研究相一致，缺磷条件下玉米的氮浓度和NO₃^-内流减少（图10）。拟南芥NRT1.1的两个同系物ZmNPF6.4和ZmNPF6.6在硝酸盐充足的条件下表现出NO₃^-转运活性，但其转录在Pi胁迫时受到抑制（图10H-I），这表明Pi的缺乏通过抑制NO₃^-转运蛋白基因的转录进而抑制玉米对NO₃^-的吸收。AtNIGT1.2的两个同系物ZmNIGT1.1和ZmNIGT1.2在Pi胁迫时被诱导，进而在N.benthamiana中抑制ZmNPF2的启动子活性（图10J-K）。这些数据表明，依赖于Pi的NIGT1.1/1.2-NRT/NPF调控通路不仅存在于模式植物拟南芥中，而且存在于传统作物中。

除了调节Pi和NO₃^-吸收以外，NIGT1.2还调节N-响应基因的转录，包括与氨基酸代谢、氨基酸运输和N代谢相关的基因，以及编码OPP、CHO和N响应转录因子的基因（图9）。这些基因在Pi饥饿期间受到转录调控，并且它们的大多数启动子都含有NIGT1.2结合的顺式调节元件（图9），这表明NIGT1.2在低Pi胁迫下调节与N相关的细胞代谢。

NO₃^-的存在同样也上调了NIGT1.2的转录，NIGT1.2过表达促进了Pi的吸收但抑制了NO₃^-的吸收（图2和图4），这一现象表明NIGT1.2在N充足的条件下参与了Pi和NO₃^-的内流。NIGT1.2直接激活了PHT1;1和PHT1;4的转录（图3），无论是在Pi胁迫与否的条件下都参与了根对Pi的运输。NIGT1.2直接下调NRT1.1的转录（图5），一个双亲性的NO₃^-转运体。NIGT1.2（也称为HHO2）还能够在不考虑磷的有效性的前提下，调节侧根的数量和长度，这可能会影响磷和NO₃^-的吸收。因此，NIGT1.1和NIGT1.2在NO₃^-和Pi有效性波动的条件下，可能在增加Pi和NO₃^-吸收中起重要作用。

最新的研究证明了氮，主要是NO₃^-，诱导了磷酸盐饥饿响应（PSR）。硝酸盐通过SPX4-PHR2模块触发磷酸盐饥饿诱导（PSI）基因的表达，PSR强烈依赖于N供应，而N供应调节PHR1的积累和周转。NIGT1.2主要由NO₃^-诱导表达，并受到转录因子PHR1的调控，这表明转录因子NIGT1.2参与了依赖硝酸盐的PSR反应。此外，NIGT1（包括NIGT1.1和NIGT1.2），参与整合来自各种环境因素的NO₃^-和Pi信号，并触发适当的响应。基于本研究结果，本研究为NIGT1.1和NIGT1.2调节的低Pi相关的磷酸盐和硝酸盐吸收提供了新的见解。

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