科研 | Plant Physiology：时序转录组学分析揭示了深水稻对淹水的关键响应
编译：景行，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Time-Course Transcriptomics Analysis Reveals Key Responses of Submerged Deepwater Rice to Flooding
译名：时序转录组学分析揭示了深水稻对淹水的关键响应
期刊：Plant Physiology
IF：6.902
发表时间：2018.4
通讯作者：Minami
通讯作者单位：日本爱知县名古屋大学生物科学与生物技术中心，464-8601
DOI号：10.1104/pp.17.00858
前言
研究方法
结果
为了对18个组织样本的转录组进行全面比较，研究进行了主成分分析(PCA)。前两个主成分(PC1和PC2)占总方差的48%(图1B),其中PC1占比26%，并在两个不同阶段(C9285 4LS和C9285 6LS)清楚地将cvT65样本(T65 6LS)与cvC9285样本分开。在T65 6LS样品中，只有24h淹没处理的样品显示出更低的PC1值，更接近于cvC9285样品。PC2(占所有方差的22%)根据淹没处理的持续时间分离样品。也就是说，每个基因型都显示出较高和较低的PC2值，分别反映了样品被淹没时间较短和较长。主成分分析的结果表明，两种水稻基因型之间依赖和独立于淹水处理的基因表达模式不同,且表达谱随淹水处理持续的时间而变化，但受C9285植株叶片发育阶段的影响较小。此外，在C9285植物中分离由4LS而不是6LS淹水特异性诱导的基因的更有针对性的尝试仅发现36个这样的基因(补充结果S1)。
淹水诱导了两种基因型中大量基因的表达变化(补充表S2；补充图S2，A和B)。为了将具有相似表达谱的基因分组，研究对所有27812个表达基因进行了k均值聚类。根据经验选择k=40作为k均值聚类，并手动将聚类分成四个主要组:(1)在C9285植株中较高表达的(1019个基因)；补充数据集(S2)；(2)在cvT65植株中高表达的(1205个基因)；补充数据集(S3)；(3)在cvC9285和T65植株中均受诱导表达的(2683个基因)和(4)在cvC9285和T65植株中均被抑制表达的(4125个基因)（不包括没有可辨别表达模式的基因的簇）(图2A)。
此外，为了更好地分离淹水响应基因，研究接下来对每个基因型分别进行了k均值聚类(k = 20)(补充数据集S4-S7)。在cv C9285样本中，5个(B6、B9、B11、B12和B16)和4个(B7、B8、B15和B17)聚类分别包含淹水诱导和抑制基因(图2B)。在B6、B12和B16集群中，共有2429个基因在淹水12h左右表现出最强的表达，共有775个早期响应基因被归为B9和B11集群。在cv T65样本中，5个聚类(C1、C3、C5、C13和C17)包含总共4563个淹水诱导基因，除了C5和C17聚类中的374个早期响应基因外，大多数基因对淹水表现出相对较慢的响应(图2C)。在集群C2中，cvT65植物中514个基因的表达受到淹水的抑制。研究基于MAPMANGO评估了每组聚类中富集的基因的生物学功能。C9285或T65植物中高表达基因的MAPMAN片段的分级富集分析(P<0.05)和C9285或T65植物中淹水改变基因的数据(P<0.05)分别显示在补充表S3和S4中(在补充结果S1中描述)。
赤霉素是淹水诱导的茎伸长的关键激素，特别是具有生物活性的GA1和GA2的浓度在淹水后的C9285植株中均有增加。赤霉素生物合成始于反式香叶基-香叶基二磷酸的转化，随后经过四个酶促步骤生成GA12(图3B）。在后面的生物合成步骤中，GA13氧化酶(GA13ox)催化GA12转化为GA53，（GA12和GA53是由GA20ox通过两条平行的途径(早期13-羟基化和非13-羟基化途径)催化的）。GA20ox分别催化GA12和GA53转化为具有生物活性的GA9和GA20前体。最后，GA3ox将GA9和GA20转化为具有生物活性的GA4和GA1形式。C9285和T65植株之间编码GA13ox催化步骤前酶的基因表达模式没有显著差异。GA20ox是合成生物活性GA的关键酶，水稻有4个假定的GA20ox基因(osga20ox1–osga20ox4),本研究数据集中检测到了3个OsGA20ox基因的转录本，并且只有一个OsGA20ox基因（OsGA20ox2）在cvC9285中淹水后1h高表达(增加了15倍以上)(图3B)。另一方面，在cvT65中，OsGA20ox2的表达水平相当低(cvT65中的表达水平为1.5cpm，而C9285中的表达水平为72cpm）。淹水过程中，OsGA20ox1和OsGA20ox4在两种基因型中都低水平(低于2.5cpm)表达。在水稻的2个GA3ox基因中，只有OsGA3ox2基因在两种基因型中都有表达，淹水后表达量有少量的增加。GA2被GA2ox和CYP714D1/EUI1酶灭活。在水稻11个假定的OsGA2ox基因中，检测到8个OsGA2ox基因的表达在两种基因型间的表达模式基本相似。在本研究中，没有检测到抑制GA12、GA9和GA4的CYP714D1/EUI1的表达。此外，试验还研究了淹水过程中赤霉素信号相关基因的表达谱，发现两种基因型的SLRL1在淹水后都表达，尽管SLR1不是由淹水诱导的(补充图S3B)。然而，结果仍然难以捉摸，因为GA稳态与GA代谢和GA信号通路密切相互作用，这是由反馈、前馈调节和各种环境因素控制。
脱落酸是淹水过程中茎伸长的负调节因子，与两种淹水基因型脱落酸含量的降低相对应。在高等植物中，脱落酸前体β-胡萝卜素是由异戊烯基焦磷酸通过质体甲基赤藓糖醇磷酸途径合成的。β-胡萝卜素被几种酶催化，最终转化为脱落酸(图3C）。NCED是ABA生物合成中的限速酶，在水稻中，NCED被认为是由五个基因编码的。在本研究中发现淹水1 h后，检测到sNCED1、OSced2和OsNCED5基因，其中OSced2在两种基因型中的表达均降低。另外，在水稻基因组中，有3个基因编码脱落酸失活酶—脱落酸8’-羟化酶(ABA8ox)。本研究中，两种基因型的OsABA8ox1和OsABA8ox2基因在淹水1h后瞬时表达增加。参与脱落酸信号的基因在cv C9285和T65植物中表达相似(补充图S3C)。Hoffmann-Benning和Kende (1992)通过对深水稻品种Habiganj Aman II的离体茎段的实验表明，ABA负调节GA介导的茎伸长。为了测试ABA对整株植物中GA活性的影响，C9285植物将种子放置在含有GA3、脱落酸或GA3和脱落酸的组合的浅水中生长18 d，发现与未处理的植物相比，用GA3处理的总株高和节间长度均有增加(图3D)。脱落酸单独处理无明显效果，脱落酸和赤霉素联合处理降低了赤霉素诱导的C9285植株伸长。
JAs调控植物的生长、发育以及其对非生物和生物胁迫的响应。JAs来源于α-亚麻酸，其通过脂肪酸去饱和酶和磷脂酶A1从叶绿体膜的半乳糖脂中释放，包括花药开裂中的缺陷1（defective in anther dehiscence 1）(图4A)。α-亚麻酸通过几种酶的作用转化为OPC-8，这些酶包括脂肪氧合酶、烯化氧合酶、烯化氧环化酶和12-氧代植物二烯酸还原酶3。经过三步b-氧化后，OPC-8转化为茉莉酮酸-CoA，然后被硫酯酶裂解为(+)-7-异茉莉酮酸。最后，(+)-7-异茉莉酮基-Ile（是结合JA受体的共受体的配体）在胞质溶胶中由茉莉酮酸抗性1催化。CYP94家族成员的活性因为(+)-7-异茉莉基-Ile羟基化而失活。在两种基因型中，推测的JA失活基因CYP94C4在淹水过程中的表达高于淹水前。此外，在淹水24h后，两种基因型内源JA水平均下降(图4B)。为了检验茉莉酸对淹水反应的影响，研究将cvC9285植物浸入含有50 mM茉莉酸甲酯的水中，并在处理3d后测量总节间长度(图4C)。茉莉酸处理显著抑制了淹水诱导的节间伸长。
图2.淹水后C9285和T65植物转录组的聚类分析。A.6LS (C9286 6LS和T65 6LS) cvC9285和T65中选定聚类的表达数据的热图表示；显示C9285 6LS (B)或T65 6LS (C)植株中的进行聚类。图中来自S1补充数据集的聚类是手工排列的。行代表由k-均值聚类生成的基因簇。圆柱代表淹水后不同时间点的样本。颜色代表每个集群的平均表达式配置文件，红色表示高表达式，蓝色表示低表达式。在每个聚类内平均之前，表达式特征基因被标准化为交叉样本和转换后的log2值的平均表达式。每个热图左侧的数字显示了指定的聚类标识符，每个聚类中的基因数在括号中。簇的总数在甲中为k=40，在乙和丙中为k=20。
两种基因型淹水过程中植物激素生物合成相关基因的不同表达模式
Kende等人(1998)提出了一个模型，描述了在调控深水稻节间快速伸长中三种植物激素乙烯、脱落酸和赤霉素之间的关系。在淹水过程中，乙烯扩散减少致乙烯积累，进而引发乙烯信号级联，导致脱落酸含量降低，赤霉素含量增加。为了研究淹水过程中受调控的激素生物合成相关基因，研究比较了cvC9285和T65植物间激素生物合成基因的表达水平。乙烯是由它的前体S-腺苷酸(SAM)产生的，通过两个步骤由阳循环产生，第一步由ACC合酶催化，将SAM转化为1-氨基环丙烷-1-羧酸，而第二步涉及ACC氧化酶，将ACC转化为乙烯（图3A）。水稻有6个假定的ACS基因(OsACS1–OsACS6)，但在这个研究的数据集中仅检测到OsACS6的表达，显示了两种基因型在淹水过程中相似的表达模式。相比之下，所有7个水稻ACO转录本(OSACO1–OSACO7)都检测到了。在这两种基因型中，OsACO1、OsACO2、OsACO3和OsACO7显示出中等至高的表达水平，而OsACO4、OsACO5和OsACO6仅在非常低的水平表达。淹水显著诱导两种基因型的OsACO7表达，cvC9285的表达略高于cvT65。在cvC9285和T65植物中，乙烯信号传导相关基因的表达谱大多相似(补充图S3A)，这与在淹水过程中两种基因型乙烯水平的相似增加一致。此外，两种基因型在淹水24 h后内源JA水平均下降(图4B)。为了检验茉莉酸对淹水反应的影响，将cvC9285植物浸入含有50 mM茉莉酸甲酯的水中，并在处理3d后测量总节间长度(图4C)。令人惊讶的是，茉莉酸处理显著抑制了淹水诱导的节间伸长。
图3.淹水过程中乙烯、赤霉素和脱落酸的代谢。从A到C，乙烯(A)、GA(B)和ABA(C)代谢的示意图以及相关基因表达的热图。每行代表一个基因，各列代表淹水后不同时间点的样本，颜色代表基因表达水平，用log2fold change (FC)的百万分之一计数(cpm)表示。表达水平较低的用蓝色表示，表达水平较高的用黄色表示。AAO3，脱落酸醛氧化酶；ABA8ox，ABA-8’氧化酶；CPS，共苯磷酸合酶；CYP714，细胞色素P714GAX氧化酶；GGDP，双（牻牛儿基）二磷酸盐；KAO,ent-贝壳杉烯酸氧化酶；KO，ent-贝壳杉烯氧化酶；KS，ent-贝壳杉烯合酶；NCED，9-环氧化物蛋白酶双加氧酶；ZEP1，玉米黄质环氧化物酶1。星号表示cv C9285和T65样本之间在四个以上时间点存在显著差异的基因(错误发现率，0.05)星号表示在cv C9285和T65样品之间的四个以上时间点具有显著差异(FDR<0.05)的基因，“<”和“>”表示相对于cv C9285的差异方向。D.脱落酸和赤霉素对株高和总节间长度的影响。cv C9285 4LS植物在含有10mM Ga3和/或10 mM ABA的浅水中生长18天。横条代表至少7个生物重复的平均值，误差横条显示SE。星号表示通过测试计算的指定处理之间的显著差异(P<0.05)。
图4。淹水期间茉莉酸的代谢。A，示意图表JA代谢旁边的热图显示相关基因的表达。每行代表一个基因，各列代表淹水后不同时间点的样本，颜色代表log2转化的cpm的基因表达水平。表达水平较低的用蓝色表示，表达水平较高的用黄色表示。FDA，脂肪酸去饱和酶；DAD1，花药开裂缺陷1；PLA，磷脂酶A1；LOX，脂氧合酶；13(S)HPOT，13(S)-氢过氧十八碳三烯酸；AOS，丙二烯氧化物合酶；12，13-EOT，12，13-环氧-十八碳三烯酸；AOC，氧化丙烯环化酶；OPDA，顺式-(+)-12-氧代-植物二烯酸；OPR,12-氧代-植物二烯酸还原酶；OPC-8，3-氧代-2-(29-戊烯基)-环戊烷-1-辛酸；OPCL1，酰基激活酶；ACX，酰基辅酶a氧化酶；MFP，多功能蛋白质；KAT,3-酮酰基辅酶a硫酶；TS2，tasselseed2；JA-CoA，茉莉酮酸；(+)-7-iso-JA，(+)-7-异茉莉基；JAR1，茉莉酸抗性1；JA-lle，(+)-7-异茉莉醛-1-腈；CYP94，细胞色素P94。星号表示cv C9285和T65样本之间在四个以上时间点存在显著差异的基因(FDR<0.05)，“<”和“>”相对于cv C9285的差异方向。B.C9285和T65植物在淹水24h期间茎基部区域的内源JA水平。符号代表至少五次生物复制的平均值，误差线代表标准差。星号表示通过测试计算的C9285和T65样本之间的显著差异(P < 0.05)。C.在淹水过程中，茉莉酸抑制节间伸长。cvC9285 6LS植物被淹没在含有50mm茉莉酸甲酯(MeJA)的水中3天。横条代表至少12个生物复制的平均值，误差横条显示标准差。星号表示通过测验计算出的指定处理之间的显著差异(P<0.05)。
淹没处理对海藻糖代谢和发酵相关途径有基因型特异性影响
本研究进一步分析了其他相关途径中的基因表达，以了解深水稻在淹水条件下的代谢适应性。利用MAPMAN软件对代谢途径的比较分析表明，在cv C9285植物中，与海藻糖代谢(补充图S4A)和发酵(补充图S4B)相关的基因在淹水1h后被诱导。淹水后，NO3-生成途径(补充图S4C)中的基因表达也上调，但它们的绝对表达水平非常低。
海藻糖是一种二糖，在碳代谢和对生物和非生物胁迫的耐受性中发挥作用。在植物中，海藻糖是通过海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)的后续作用，由UDP-Glc和Glc-6-P两步合成的，海藻糖的降解是由海藻糖酶催化的(TRE；图5A）。在本研究的数据集中，研究者检测到海藻糖代谢相关基因的表达，包括13个TPS(共14个)、7个TPP(共13个)和1个TRE基因。C9285植株中的一些TPS基因对淹水有明显的反应。值得注意的是，在cvC9285植物中，3个TPS基因(OsTPS12、OsTPS13和OsTPS14)对淹水有强烈的诱导反应，而在cvT65植物中没有(图5B)。在cvC9285植物中，OsTPP1和OsTPP11表现出对淹水的响应的高表达，而在淹水后，OsTPP2在cvT65中以相对低的水平被诱导表达(图5C)。TRE在两种基因型的表达模式相似(图5D)。
图5.淹水过程中海藻糖代谢相关基因的表达。A.海藻糖代谢途径的示意图。Glu-6P，Glc-6-P；UDPG。B到D，在淹水后指定时间点，C9285 6LS(黑色)和T65 6LS(橙色)植物淹水期间海藻糖代谢相关基因的表达。数据点显示表达水平为三次生物复制的平均cpm，误差条显示标准差。黑色和橙色星号分别表示cv C9285和T65样品在每个时间点从0 h开始的显著差异(P<0.05)。“Ɨ”表cv C9285和T65样品之间存在显著差异(FDR<0.05)。
在无氧条件下，有氧呼吸的氧气是有限的，植物细胞进行无氧呼吸(糖酵解和发酵)来产生能量。糖酵解途径产生三磷酸腺苷，随后的发酵步骤产生用于维持糖酵解的NAD+和一些代谢物。发酵将糖酵解产生的丙酮酸转化为其他代谢物，如丙氨酸、乳酸盐、乙醇和乙酸盐(图6A)。丙氨酸是由丙酮酸和谷氨酸通过丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)合成的，而乳酸是通过乳酸脱氢酶(LDH)还原丙酮酸形成的。丙酮酸脱羧酶将丙酮酸转化为乙醛。为了去除乙醛的毒性，乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶随后分别催化乙醛转化为乙醇或乙酸。有趣的是，研究发现两个乳酸脱氢酶基因(乳酸脱氢酶-A和乳酸脱氢酶-B)在cv C9285淹水1h后被强烈而特异地诱导，但在cv T65植物中没有(图6B)。在其他发酵相关基因中，OsAlaAT1、OsPDC1、OsPDC2和OsPDC3、Os05g0469800、OsADH1和OsADH2以及OsALDH2a似乎在两种基因型中淹水后增加，而ALDH1家族中的基因似乎在淹水期间表现出不同的表达模式。
图6.淹水过程中发酵相关基因的表达。A.三种发酵途径的示意图。B.在淹水后的指定时间点，C9285 6LS(黑色)和T65 6LS(橙色)植物淹水期间发酵相关基因的表达。数据点显示表达水平为三次生物复制的平均cpm，误差条显示标准差。图表的排列反映了厌氧能源生产的不同可能性。磷酸烯醇丙酮酸。黑色和橙色星号分别表示cvC9285和T65样品在每个时间点从0h开始的显著差异(P<0.05)。“Ɨ”表cvC9285和T65样品之间存在显著差异(P<0.05)。使用似然比测试计算p。
淹水诱导C9285和T65植物细胞壁形成相关基因的差异表达谱
在非融合条件下，与cv T65植物相比，与细胞壁形成和次级代谢途径相关的基因在cv C9285植物中表现出更高的表达(补充图S5，A–D)。植物细胞壁提供机械强度，调节生长，作为扩散的屏障，保护植物对抗病原体。在cv C9285植物中表达较高的细胞壁相关转录物编码细胞壁修饰蛋白α-和β-扩展蛋白(EXPAs和EXPBs)、木葡聚糖内转移糖基化酶/水解酶(XTHs)、果胶酯酶(PMEs)和结构细胞壁蛋白(类纤维束蛋白阿拉伯半乳聚糖[FLAs]和延伸蛋白；图7A)。在T65植株中，几乎所有基因都对淹水有反应，在淹水24 h内表达水平最终达到C9285。C9285植株中有几个基因受到淹水的强烈诱导，特别是EXPB6、EXPB7、OsXTH23和OsXTH1基因，C9285植株中有两个PMEs (Os01g0880300和Os01g0312500)、三个Fla7(FLA 7、FLA6和FLA2)和两个extensis(OS02g 0138000和Os01g0594300)对淹水有显著的反应。在非融合条件下，与cv C9285相比，cv C9285中参与类黄酮、花色素苷和苯丙素代谢以及木质素和简单酚的生物合成(例如，参与木质素聚合的漆酶)的基因表达更高(补充图5C)。木质素是木质素单体的复杂聚合物，作为次生细胞壁的一个组成部分，它能强化细胞壁。因此，细胞壁木质化可能在抑制深水稻的快速生长中起作用，导致其茎在不融合的条件下伸长速度缓慢。研究者研究了木质素生物合成相关基因对淹水的转录反应，并重点研究了编码针叶树醇/芥子醇脱氢酶(CAD/SAD)的基因，该基因催化木质素单体生物合成的最后一步(补充图S6A)。在cv C9285植物中，在11个CAD/SAD基因中(在基因组中总共12个基因中)，OsCAD1、OsCAD2、OsCAD8B和OsCAD8C在非融合条件下高度表达，并且除了OsCAD1之外，其它受淹水诱导表达减少(图7B)。OsCAD1在两种基因型中表现出相似的表达水平，而cvT65中的其他CAD基因在淹水期间保持较低的表达水平。为了确定CAD基因表达的减少是否影响cvC9285植物伸长节间的木质素生物合成，研究者测量了cvC9285茎的木质素含量，包括(1)来自不同位置的节，(2)非伸长节间(已经停止伸长的节间)，和(3)新伸长节间(在淹水期间新伸长的节间)；图7C)。在非融合条件下，基节、非伸长节间、第二和第三节显示出相似的木质素含量(图7D)。淹水2d后，基部和第二节的总木质素含量没有变化(图7，D和E)。另一方面，在淹水2d后新伸长的节间上的第三个节表现出较低的木质素含量(图7E)。淹水2 d不影响非伸长节间的木质素含量，而新伸长节间的木质素含量低于非伸长节间。这些结果表明，通过减少CAD转录物抑制木质素生物合成有助于C9285植物节间的延长。与此一致，cv T65植物基节中的木质素含量在淹水期间没有变化(补充图S6B)。
图7.淹水对细胞壁形成相关基因表达的影响。A.淹水24 h细胞壁相关基因的表达模式。cvC9285 6LS和cvT65 6LS样品中的基因表达水平在每个时间点(0、1、3、12和24h)相对于浸没前cvT65样品的对数2倍变化(FC)来表示。显示最大cpm值大于15的基因。AGP，阿拉伯半乳聚糖蛋白。B.11个CAD/SAD基因在淹水24h期间表达的变化。数据点显示三个生物重复中表达水平为平均cpm，误差条显示标准差。C.木质素定量的节间取样区域。已经形成节间的处于七叶期(7LS)的C9285植物被浸没2天。显示了C9285植物在7LS被浸没处理之前(0d)和之后(2 d)的茎的图像。红色箭头表示茎节点。D和E，C9285植株在7LS淹水2 d前后的节和节间木质素含量。条形代表至少六次生物复制的平均值，误差条形代表标准差。根据图基-克莱默测验，不同的字母表示显著的差异。
图8.C9285-特异基因座的淹水诱导转录本。显示了IRGSP-1.0参考基因组中可能缺失的选定基因座的表达。每一行代表一个位点，每一列代表淹水后不同时间点的样本，颜色代表基因表达水平，用log2fold change (FC)的cpm归一化为不同时间点所有样本的平均表达。
显示了在C9285 6LS植物中淹水后表达至少增加2倍的基因。来自cv C9285-独特转录本的完整表达数据可在补充数据集S10中找到，序列数据在补充数据集S12至S14中提供。AA,氨基酸；fold change,折换。
淹水条件下ERF转录因子基因的表达
MAPMAN过表达分析显示，在2种基因型中，来自AP2/EREBP家族的转录因子基因在淹水诱导的基因中显著富集(补充表S4，A和B)。为了研究所有转录因子基因对淹水的响应，本研究数据集中的基因根据植物转录因子数据库3.0版(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/；补充数据集S8；补充图S7；补充结果(S1)。有趣的是，这些簇总共包含10个ERF基因(补充图S7)。ERFs属于AP2/EREBP超家族，是一个植物特异性转录因子家族，包括三个亚家族:(1) AP2家族蛋白，包含两个重复的AP2 DNA结合域；(2)含有单个AP2结构域的ERF家族蛋白；和(3)包含B3 DNA结合结构域和单个AP2结构域的RAV家族蛋白质。Nakano等人(2006)将水稻ERF蛋白家族(共有139个基因)分为15个亚家族，包括28个亚组。在本研究的数据集中，研究者将ERF基因按照这些亚组来分，发现所有转录因子中，发现有115个是ERF蛋白基因，包括41、10和64个基因，它们分别在淹水期间表达增加、减少和不变(补充表S5)。来自亚组IIa、IIIc、VIIa、VIIb、IXa、Xa、Xb、Xc和XI的ERF基因在C9285植物中主要表现受淹水诱导表达增加，而亚组IIIe和Va的基因在淹水处理下表达减少。补充图S8显示了淹水诱导的ERF基因的表达谱。SUB1位点编码三个ERF蛋白转录因子基因(SUB1A、SUB1B和SUB1C)；然而，cvC9285的基因组仅包含SUB1B和SUB1C，但不包含SUB1A。在cvC9285植物中，SU1B(OsERF # 063)和SU1C(OsERFf # 073)在淹水1h后分别增加了3.2倍和2.7倍(补充图S8A)。在cvC9285植物中作为节间伸长的正调节因子而在cvT65植物中不存在的SK1和SK2基因的表达也因淹水而分别显著增加了5.3倍和3.2倍(补充图S8B)。
cvC9285植物中GCC盒样启动子元件富集在特异表达基因的启动子中
利用k-均值聚类，研究者分离出189个在C9285植物中特异表达的基因(补充数据集S9)。它们的推定启动子区(转录起始位点上游1 kb)是通过将cvC9285植物基因组DNA的读数与日本晴（一种粳稻品种）参考基因组进行比对而构建的。然后用MEME分析构建的启动子序列的富集的DNA序列基序。研究者在启动子序列中发现了两个富含序列的基因盒样元件(补充图S9),共有的DNA结合基序(GCCGCC)被ERF蛋白识别.
C9285差异表达基因的鉴定与分析
研究约85%的cvC9285RNA测序(RNA-Seq)读数可定位到日本晴（一种粳稻品种）参考基因组(补充表S1)，但cvC9285有可能在参考基因组中缺失额外的基因，如SK1和SK2。因此，本研究进行了一次有针对性的转录物从头组装，以检测cv C9285特异性转录物(补充图S10补充方法(S1)。研究者使用C9285基因组DNA的47，978，704对端阅读(约203个覆盖范围)来组装C9285特异性基因组区域，并使用RNA-Seq阅读在这些区域中检测到的定量转录物。然后研究者将分析限制在那些高水平表达的转录本，被淹没强烈诱导的转录本，或者有有趣的注释的转录本。总之，发现在33个基因组重叠群上的86个转录基因座要么对cvC9285具有假定的独特性，要么与日本晴参考不同，因此用标准参数作图不能产生比对(补充数据集S10和S12–S14)。在这86个位点中，有两个编码全长SK1和SK2转录本。包含SK1的基因组重叠群(重叠群_21；5，776 bp)和SK2(contig _ 8；12，025 bp)基因座几乎与用于SK1和SK2的基于图谱的克隆的细菌人工染色体克隆的部分完全一致。当研究者量化来自这些重叠群的SK1和SK2基因的表达时，发现淹没1h后转录活性的早期增加，随后下降(补充图S8B)。这表明本研究定向组装策略能够正确识别独特的cv C9285转录物，包括它们的基因组序列和表达模式。研究者发现11个新的转录本在淹没1h后具有至少2倍高的表达水平(图8)。除了SK1和SK2，这些转录本中的大多数都没有编码特征明确的蛋白质。相反，使用BLASTP的序列比较报告了至少六种病原体或疾病相关的蛋白质，剩下的三种蛋白质被注释为未知功能域、反转座子相关的和SAM依赖的甲基转移酶。
讨论
这项研究的总体目标是了解深水稻cvC9285在淹水期间与逃逸策略相关的转录反应。通过RNA-Seq方法对整个转录组进行分类揭示了深水稻(cv C9285)和非深水稻(cv T65)植物之间的基因表达差异，以及这两种基因型对淹水的独特和常见反应。本研究的综合转录组分析结果有助于发现水稻淹水过程中调控代谢途径的关键基因。
乙烯、赤霉素和脱落酸代谢相关的转录物在淹水后差异表达
先前的研究表明，激素乙烯、赤霉素和脱落酸调节淹没深水稻节间伸长反应。在乙烯生物合成基因中，据报道，深水稻受淹水刺激增加了OsACS1、OsACS5和OsACO1。另一方面，在本研究的数据中，两种基因型的OsACO7转录物和蛋白质在淹水过程中积累(图3A；补充图S11A)。水下深水稻中的乙烯积累归因于乙烯扩散的减少和乙烯生物合成的增强。本研究之前的研究表明，乙烯积累在C9285和T65植物中都很常见。本研究的转录分析支持在淹水期间OsACO7参与了两种基因型的乙烯积累。据报道，在淹水过程中，OsACO7没有参与乙烯生物合成，尽管以前的大多数研究使用了非脱水水稻品种。在淹水条件下，积累的乙烯促进了赤霉素的积累，促进了水稻节间伸长。有趣的是，与乙烯生物合成不同，赤霉素生物合成的激活仅发生在cvC9285植物中。在本研究的数据中，在cvC9285中，OsGA20ox2(也称为SD1)表达水平被强而特异地诱导，而在cvT65中没有(图3B)。赤霉素20ox2是产生赤霉素的关键位点；因此，其表达的增加很可能是沉水cv C9285植物中较高的Ga1和Ga4积累的原因(补充图S12F)。
在具有SUB1A的耐淹水稻的情况下，SUB1A通过GA信号抑制子SLR1和SLRL1的积累抑制GA信号，导致在淹水条件下茎和叶的伸长受限。因此，深水稻品种C9285中SUB1A的缺乏可能解释了在淹水过程中促进茎和叶伸长的生物活性赤霉素水平的积累。据报道，赤霉素诱导的基因生长调节因子1 (OsGRF1)和赤霉素类刺激的转录物(stimulated transcript (GAST)-like)基因(OsGSR1)增强了水稻的茎伸长。有趣的是，两个赤霉素类刺激的转录物基因(Os05g0376800和OsGSR1)在C9285植物中在淹水期间表达较高，尽管在本研究的数据集(补充图S11，B和C)中，OsGRF1在淹水期间没有被诱导，这表明赤霉素类刺激的转录物基因可能参与了C9285植物淹水期间GA诱导的茎伸长。在淹水和乙烯处理下，对节间伸长有拮抗作用的脱落酸含量降低。脱落酸含量的降低是C9285和T65植株对淹水的共同反应。本研究的数据显示，编码脱落酸生物合成中的限速酶之一的OsNCED2的转录水平降低，并且在淹水期间，编码脱落酸失活酶的OsABA8ox1和OsABA8ox2在两种基因型中都被上调(图3C)，这表明脱落酸含量的降低可能是由两种基因型中与脱落酸代谢相关的基因的表达水平的变化所解释的。
茉莉酸是一种与深水稻茎伸长相关的新调节因子
Kende等人报道了乙烯、脱落酸和赤霉素是深水稻节间伸长的关键调节因子。本研究证明了淹水调节水稻茎节样本中内源茉莉酸的含量，茉莉酸抑制了淹水诱导的C9285植株节间伸长(图4)。CYP94C2b编码一种细胞色素P450酶，并参与JA-Ile的失活。本研究的数据显示，CYP94C4是一种主要表达的CYP94C基因，在淹水过程中，在两种基因型的表达水平都有所增加。因此，CYP94C4的增加可能调节内源JA含量的降低。茉莉酸的减少是两种基因型对淹水的共同反应，如淹水过程中乙烯和脱落酸含量的变化。6LS的非脱水水稻cvT65即使在赤霉素处理的情况下也没有伸长节间的能力，表明cvT65植株中JA含量的变化不影响茎的伸长。
对茉莉酸和赤霉素信号通路之间的相互作用的研究表明，在拟南芥中，赤霉素在参与植物生长和发育过程的茉莉酸信号通路中起拮抗作用。此外，杨等人(2012)表明，JA介导的水稻生长抑制是由DELLA阻遏物水平的变化和对GA信号的干扰引起的。研究的数据表明，深水稻中赤霉素介导的节间伸长需要通过降低淹水条件下的赤霉素含量来抑制赤霉素的功能。
C9285和T65植物差异表达海藻糖和发酵代谢相关基因
海藻糖是一种碳源和渗透保护剂，通过稳定蛋白质和细胞膜抵抗各种压力而积累。另一方面，海藻糖-6-磷酸(Tre6P)，海藻糖的前体，作为信号代谢物，协调碳同化、淀粉合成、氮代谢、生长和发育。Tre6P-Suc比值的变化是植物在胁迫条件下的重要稳态机制；因此，Tre6P还通过Suc水平的负反馈调节作为Suc状态的信号。在水稻中，OsTPS1或OsTPP1的过表达增强了对非生物胁迫的耐受性，导致胁迫相关基因的表达。OsTPP7(本文中的OsTPP11)也通过调节糖信号中的海藻糖含量和Tre6P/Suc稳态而不是Tre6P含量来提高水稻幼苗的厌氧萌发耐受性。在研究的数据中，尽管在两种基因型中，包括OsTPS1、OsTPP1和OsTPP11在内的几个OsTPS1基因通过淹水表达，但是在cvC9285中，OsTPS12、OsTPS13和OsTPS14的表达被淹水显著诱导，但是在cvT65中保持在较低水平(图5B)，这一结果表明，沉水过程中海藻糖的代谢在cvC9285和T65之间受到不同程度的调节，海藻糖和Tre6P可能在沉水cvC9285植物中积累更多，有助于深水稻抵御和适应沉水胁迫的能力。在含有沉水SUB1A-1的M202(SUB1)水稻幼苗和缺氧胚芽鞘中，海藻糖生物合成途径被激活，这表明深水稻也利用这种途径作为对沉水的代谢适应的一部分。
在低氧条件下，糖酵解主要被引导到发酵途径(而不是有氧呼吸)，这是细胞生存产生能量和为其他途径循环碳所必需的。本研究的数据显示，在两种基因型中，淹水期间发酵相关基因PDCs、ADH1和ADH2以及ALDH2a的表达增加(图6B)。一个功能性的SUB1基因座在淹水过程中调节PDC和ADH的基因表达和酶活性。因此，含有SUB1A-1的水稻，耐淹品种13A，积累较少的醛类，因为ADH的高表达增强了乙醛向中性和可扩散乙醇的解毒作用。淹水也诱导水稻胚芽鞘中醛脱氢酶2的表达，但不诱导醛脱氢酶1的表达。本研究的的结果暗示发酵途径在两种基因型中都是活跃的，并且酶ADH和ALDH2a可能参与了在淹水期间响应低氧而去除有毒的酒精和乙醛(图6A)。OsAlaAT1表达的增加(图6B)进一步支持cvC9285和T65中的活性发酵途径也产生Ala。这些结果与水稻品种日本晴的液泡胚芽鞘中丙氨酸氨基转移酶、聚碳酸酯和多动症的活性增加相一致；然而，在他们的研究中，乳酸脱氢酶的活性和乳酸盐的含量在有氧和无氧条件下都是相似的。在本研究的数据集中，与T65植物相比，C9285植物中两个LDH基因的转录本在淹水后被强烈上调(图6B)。乳酸盐的形成导致细胞溶质的酸碱度降低，细胞质的初始酸化有助于实现PDC的最佳活性，这反过来又促进了从乳酸盐到乙醇发酵的转变。因此，与C9285相比，C9285植物中LDH转录物的丰富可能导致细胞质中乳酸的更高积累和细胞溶质酸碱度的更强的乳酸依赖性降低，更有利于乙醇发酵。最近，Lee等人报道了乳酸盐与NDRG3结合，NDRG 3是一种氧调节蛋白，并激活Raf-ERK信号以促进人细胞缺氧过程中的细胞生长和血管生成，这表明植物细胞中的乳酸盐可能在响应缺氧的类似信号通路中起信号分子的作用。
C9285植物细胞壁合成和修饰基因对淹水的响应差异表达
cvC9285和T65植物对淹水具有不同反应的基因富集在细胞壁相关的类别中(补充图S2C)。此外，编码细胞壁相关蛋白的基因，如EXPs、XTHs、PMEs和结构细胞壁蛋白(FLAs和extensins)，在两种基因型中都被归类为淹水诱导基因(补充表S4，A和B)，并且在非亚融合条件下在cv C9285植物中表现出更高的表达(图7A)。细胞的伸长需要细胞壁的松弛，包括细胞壁松弛因子如EXPs。在酸性条件下，EXP活性增加，这是由质膜H+-ATPase活性通过生长素诱导的生长素小RNA蛋白质控制的。在深水稻中，观察到EXPs的表达与酸化诱导的细胞壁延展性呈正相关，它们可能在节间伸长中起作用。EXPs和XTHs一起控制纤维取向和基质的粘弹性，促进细胞壁的膨胀。XTH活性可能在长柄繁缕避荫伸长反应中增强EXP活性。在水稻中，XTHs可以在伸长茎的维管束的细胞壁形成中发挥作用。聚甲基丙烯酸甲酯催化果胶的去甲基酯化反应，果胶是一种富含半乳糖的细胞壁聚合物，能形成聚合物凝胶状结构，从而增加细胞壁的孔隙率和细胞的延伸。Jeong等人表明，在经历细胞伸长的萌发芽中检测到高PME活性。细胞壁也受结构细胞壁蛋白的调节，如阿拉伯半乳聚糖蛋白，它参与拟南芥和黄瓜的伸长和生长。本研究发现诱导了与细胞壁疏松相关的几个基因的表达。这些基因可能有助于细胞壁重建和增加细胞壁延展性，导致C9285植物在淹水期间节间快速伸长的进一步增强。
木质素积累是细胞壁修饰的一部分，细胞壁修饰导致机械强度增加，但也抑制细胞伸长。在cv C9285植物中，几个编码催化木质素单体合成最后步骤的关键酶的CAD基因的表达，在淹水期间降低(图7B)，导致淹水期间新伸长节间中木质素含量降低(图7E)。在淹水条件下，两种基因型的过氧化物酶基因表现出不同的表达模式(补充图S2C；补充结果S1)，并归类为淹水诱导基因(补充表S4，A和B)。有趣的是，在早期淹水条件下，过氧化物酶基因在cv C9285植物中的表达水平高于cv T65植物(补充图S6C)。过氧化物酶参与木质化、应激防御和活性氧产生的调节。此外，过氧化物酶产生的羟基自由基也可能在细胞壁疏松和细胞伸长中起作用，如在玉米根中。因此，淹水响应过氧化物酶可能在C9285植物细胞壁疏松和伸长节间木质化中起作用。
ERF蛋白基因在C9285和T65沉水植物中的差异表达
ERF是乙烯信号通路的主要下游成分。在本研究的分析中，在115个检测到的ERF家族转录本中，在cvC9285植物中，Ib、IIa、IIIc、VII、VIIIa、IXa、X和XI亚组中的39个基因被上调，而在IIIe和Va亚组中的10个基因被下调(补充表S5)，表明乙烯信号是深水稻对淹水反应的重要调节途径。有趣的是，在第七组ERF家族的所有15个成员中，12个基因，包括SU1B(OsERF # 063)和SU1C(OsERF # 073)，是由C9285植物的淹水诱导的(补充表S5；补充图S8A)。第七组ERF家族的成员在缺氧条件下通过拟南芥蛋白质降解的氮端规则途径充当氧传感器，并在多种植物中的多种胁迫耐受性中发挥作用，如干旱、寒冷、病原体攻击、盐度、渗透胁迫和淹水。本研究发现其他三个基因(OsERF#70、OsERF#71和OsERF#72)编码CMVII基序，该基序被预测为有丝分裂原激活蛋白激酶(MPKs)的磷酸化位点，在C9285植物中显示对淹水无反应的表达(补充图S13)。MPKs磷酸化包括ERF在内的大量转录因子，MPK诱导的水稻ERF磷酸化增强了它们的转录活性和环境胁迫耐受性。最近，据报道，OsMPK3磷酸化SUB1A-1，以SUB1A-1依赖性方式控制芽伸长，尽管磷酸化位点不位于CMVII-4基序。在cv C9285植物中，第七组编码无磷酸化位点的蛋白质的ERF蛋白的所有成员都是被淹没诱导的，并且一些第七组ERF蛋白(OsERF#59、OsERF#61、OsERF#63、OsERF#64、OsERF#66和OsERF#67)的淹没诱导表达水平在淹没期间比cvT65植物高(补充图S13)。这些结果表明，依赖于磷酸化的第七类ERF蛋白可能对深水稻淹水诱导的应激反应很重要，尽管淹水仍有可能通过多相蛋白激酶诱导ERF蛋白磷酸化。亚组IIa和VIIIa中的其他淹没诱导的ERF蛋白编码含有ERF蛋白相关的两亲性抑制基序(DLNxxP)的蛋白质，该基序作为转录抑制结构域。由于含雌激素受体的转录因子调节各种胁迫反应，淹水诱导的ERF可能参与负调控淹水反应可分配基因的表达。在研究的数据中，IIIc组、IXa组和X组的ERF蛋白也显示了对淹水反应的上调表达(补充表S5)。在拟南芥中，IIIc、IXa和X ERFs分别在耐受环境胁迫如冷冻、盐和脱水(如冷结合因子/脱水反应元件结合蛋白1)、乙烯-JA信号通路以及对脱落酸和各种胁迫的反应中发挥作用。就XI ERF蛋白组而言，该家族存在于水稻中，但不存在于拟南芥中，这表明这些基因具有水稻特异性功能。
一种IIIe类ERF蛋白，TINY，在减少细胞膨胀和分化中起作用，导致拟南芥中的矮化表型。在cv C9285植物中，两个IIIe类ERF蛋白家族基因被淹水下调，表明IIIe类ERF蛋白可能影响淹水过程中的细胞增殖。VIIIa组中的拟南芥ERF11抑制乙烯生物合成基因，但通过促进GA积累和抑制DELLA功能来促进细胞伸长。在水稻中，Xb组的OsEATB (OsERF#102)和VIIIa组的OsERF3 (OsERF#075)负调节节间伸长。在cv C9285植物中，OsEATB不表达，OsERF3在淹水过程中也不差异表达(补充图S11D)，表明在cv C9285植物中，这两种负调节因子不参与GA介导的淹水过程中节间伸长。SUB1A上调12个ERF蛋白家族基因的转录表达水平。尽管C9285基因组中不存在SUB1A基因，但C9285植物中的6个SUB1A依赖性表达基因(即OsERF#025、OsERF#066、OsERF#067、OsERF#068、OsERF#076和OsERF#077)也是由淹水诱导的(补充图S8A)。所有SUB1A下游ERF蛋白基因都属于IIIc、VIIa和VIIIa亚家族。这表明这些基因在cv C9285植物中也受其他因素的调控，并可能表明它们的表达与深水稻节间伸长没有直接关系。
ERF转录因子通过识别GCC盒调控序列(GCCGCC[核心基序])与它们的靶基因(如病原体相关基因)的启动子区结合。研究的电子分析显示，两个GCC盒样基序(G/CCGGCGGCGG和CGCCGCCGCC)在cv C9285植物中高表达基因的启动子区域中富集(补充图S9)，表明这些具有GCC盒样基序的基因优先受ERFs调控。一些淹水诱导的ERF蛋白基因在淹水前后在C9285中的表达高于T65(补充图S8A)。这一结果表明，cv C9285中的ERF基因与其假定的下游靶基因的组成性高表达相关。最近，Gasch等人发现了一种新的低氧响应启动子元件，它是ERF VIIs的结合位点，与拟南芥中氮端规则途径的关键调节因子AP2 2 (RAP2.2)和RAP2.12相关。然而，本研究对cv C9285富集基因的启动子分析中，研究没有发现低氧反应启动子元件基序。水下节点中的氧水平可能比预期的高得多，原因有二:(1)从水层扩散到节点中，以及(2)水下光合作用。在光照淹没的情况下，深水稻的氧浓度最初下降，但通过水下光合作用在90分钟内恢复。因此，研究的数据可能不适合研究缺氧，因为研究在光照条件下收集了所有样本。
深水稻对淹水的转录反应模型
研究者提出了深水稻cv C9285逃生策略期间的淹没响应模型(补充图S14)。淹水使植物细胞受到多种压力，例如气体扩散受限、光照强度降低、病原体感染的高风险以及摄氧量降低。为了避免淹水造成的严重伤害，cv C9285植物进化成能迅速拉长节间和叶片。研究揭示了淹水过程中植物激素乙烯、脱落酸、赤霉素和茉莉酸含量的变化是转录调控的。乙烯信号通过改变许多基因的表达和植物激素水平导致生物和非生物胁迫耐受性，并且本研究的数据很大程度上显示了在淹水期间乙烯信号的假定下游成分的变化。
研究者还提出JA是C9285植物淹水诱导节间伸长的一种新的调节剂。在深水稻中，赤霉素在伸长反应中具有重要作用，因为赤霉素处理诱导细胞壁相关基因如胞外多糖的表达，并改变CAD的活性。研究者发现cv C9285活性气体的特异性积累可能受淹水期间GA20ox2表达的控制(图3B)，并且细胞壁相关基因在cv C9285植物中显示较高的表达(图7A)。此外，cv C9285植物中木质素含量的降低也有利于节间在淹水条件下的伸长。细胞壁代谢的整体改变也可能有助于深水稻节间的快速伸长。在转录因子基因中，ERF蛋白家族基因在C9285植物中的表达水平较高。有趣的是，在cv C9285植物中特异表达的基因包含被ERFs识别的GCC盒样基序，这表明乙烯信号和通过ERFs的转录反应途径可能是cv C9285植物淹水反应的关键因素。事实上，水稻乙烯不敏感蛋白3-LIKE1是乙烯信号传导的主要调节因子，它与乙烯/淹水诱导的ERF转录因子SK1/2的启动子区结合，该转录因子在cv C9285植物中对节间伸长进行积极但非排他性的调节。本研究通过从头组装分析在cv C9285基因组中没有发现任何cv C9285特异性的新的淹水诱导的转录因子，并且SK1/2的单独存在不能导致完整的茎伸长反应，因此很可能涉及与SK1/2协同的其他转录因子。
在沼泽红假单胞菌中，与光形态发生和避光相关的基因似乎能调节水下伸长反应。在这个研究的数据中，C9285植物中的光信号调节基因的表达模式没有显示任何明显的基因型或淹水特异性模式(补充图S15)。在cv C9285和T65植物中，参与发酵和海藻糖代谢途径的基因对淹水有反应，研究发现在cv C9285植物中，TPSs和LDHs在淹水期间优先表达(图5和图6)，这表明与正常水稻如cv T65植物相比，这些代谢活性在淹水期间在cv C9285植物中更强地增加，导致对长期淹水的适应。
本研究的实验表明，许多致病相关蛋白优先在每个水稻品种中表达(补充表S3)，并且编码抗病蛋白的几个基因被鉴定为cv C9285-独特转录物(图8)。淹水条件增加了植物中病原体感染的风险。因此，稻田中的水稻具有保护机制，防止损害使它们容易受到病原体的侵害。因此，这些cv C9285特异性基因可能在cv C9285植物部分长期淹水期间充当病原体防御途径。本研究的研究在cv C9285植物中鉴定了对淹水反应的基因型特异性基因，并假设推定的关键基因将与cv C9285植物中淹水诱导的生理反应相关。此外，本研究表明乙烯是淹水响应的主要驱动力之一，JA是C9285植物淹水诱导节间伸长的一种新的负调节因子。该网络涉及由淹没引起的变化和遗传因素，复杂地调节深水稻的水下伸长和适应。
评论
这项研究的总体目标是了解深水稻在淹水期间与逃逸策略相关的转录反应。通过RNA-Seq方法对整个转录组揭示了深水稻(cv C9285)和非深水稻(cv T65)植物之间的基因表达差异以及内源激素含量的变化，主要从赤霉素、脱落酸、茉莉酸相关调控基因、海藻糖代谢和发酵相关途径、细胞壁形成、乙烯调控转录组因子ERF的基因表达模式GCC盒状启动子元件的富集和深水稻差异表达基因的鉴定和分析几方面来阐述，分析这两种基因型对淹水的特异和常见反应。本研究的综合转录组分析结果有助于发现水稻淹水过程中调控代谢途径的关键基因。
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