综述|PHARMACOL THERAPEUT：从组学研究中了解糖皮质激素反应
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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糖皮质激素药物常应用于一些疾病的治疗包括自身免疫疾病、哮喘以及癌症。尽管作用的生物学信号通路已经被广泛了解，但是细胞类型特异的糖皮质激素的作用机制以及病人响应不同的原因尚不清楚。近些年，人类体外研究利用基因组、转录组以及其他组学方法解决了这些问题。在本研究中研究者总结了糖皮质激素响应的几个关键组学研究，并且确定了与糖皮质激素反应相关现有知识的缺口，需要在未来进一步研究。
论文ID
原名：Insights into glucocorticoid responses derived from omics studies
译名：从组学研究中了解糖皮质激素反应
期刊：pharmacology & therapeutic
IF：10.577
发表时间：2020年9月
通讯作者：Blanca E. Himes
通讯作者单位：宾夕法尼亚大学
DOI号：10.1016/j.pharmthera.2020.107674
进展
糖皮质激素是肾上腺合成和释放的类固醇激素，能够对代谢、炎症、免疫以及凋亡信号通路进行调节，在机体应答内部和环境变化维持内稳态中发挥重要作用。糖皮质激素通过促进糖异生影响正常代谢，可以提高肝细胞内糖原的储存，降低骨骼肌和脂肪组织中葡萄糖的摄取和利用。合成的糖皮质激素具有很强抗炎、免疫抑制和抗增殖的特性，可用于治疗多种疾病，包括自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、牛皮癣、湿疹）、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和一些癌症(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL))。慢性糖皮质激素的使用会导致有害的副作用，包括骨质疏松、高血糖、糖尿病、肥胖、心血管疾病以及抑郁症。因此糖皮质激素最好短时间内服用，如果可能的话靶向相关的组织。虽然糖皮质激素表现出细胞和组织特异性的反应，糖皮质激素的组织靶向治疗通常是通过选择组织特异性通路实现的，而不是靶向细胞类型特异性的信号通路。对特定的组织进行糖皮质激素可以降低系统的副作用，但是在靶向组织中慢性应用可能引起耐受性，进而导致剂量的增加和更糟糕的副作用。因此对细胞类型特异糖皮质激素反应的了解将会引导克服副作用和耐受性更精准的治疗。
个体间对糖皮质激素反应的多样性及其抗性的发展一直以来就被认知，但缺乏对过程的了解。在罕见的案例中，由于糖皮质激素受体GR或者基础应答机制的突变导致一些个体对糖皮质激素不敏感或者固有的对类固醇不响应。更常见的是，糖皮质激素耐受提示在一些患者中需要高剂量的糖皮质激素，并且在此之后延长糖皮质激素的使用，患者可能需要更高的剂量来维持最初观察到的较好的治疗效果。糖皮质激素反应提示体外实验糖皮质激素暴露后观察到的特异效应或者在病人中糖皮质激素处理后临床症状的改变。尽管术语“不敏感”、“耐受”、“应答”有时候可以互换使用，但在理解特定上下文中是非常重要的。有些个体被认为对糖皮质激素不响应，因为治疗后症状仍然存在，尽管在细胞水平上糖皮质激素会引起预期的反应。在这种情况下，糖皮质激素“耐受”或者“不响应”可能是由于存在包含除了类固醇敏感的其他信号通路的疾病亚型，因此单独使用糖皮质激素并不能导致充分的治疗效果。
吸入型糖皮质激素直接作用于肺，能够成功地控制大多数持续性哮喘患者的症状，但是高达30%严重哮喘的患者需要长期口服糖皮质激素以控制疾病。此外，大约10%的哮喘患者在高剂量糖皮质激素治疗后仍然具有症状，表现出阴性的副作用。近期开发的生物制剂对于一些哮喘亚型的治疗有效，其中包括一些对类固醇不响应的。在10%-30%未处理的ALL患者中观察到了糖皮质激素耐受和复发。因此对糖皮质激素反应机制的全面了解有助于精准方法的发展更好的识别和治疗病人。
组学的方法能够无差别的测量生物系统中多层面的信息并且已经应用于揭示生物医学的大量问题，包括肺部疾病和糖皮质激素反应：药物基因组学已经探究了病人应答糖皮质激素过程中的遗传决定因素；转录组和表观基因组学研究也衡量了细胞类型特异性的转录变化并将其与DNA结合的转录因子联系；蛋白组学和代谢组学探究了反应糖皮质激素应答的下游生物标记物。在本文中研究者概述了组学方法的应用以更好的了解糖皮质激素的反应，同时关注了哮喘和ALL中的应用，因为这两种情况利用多组学探究了两条糖皮质激素改变的信号通路：炎症和细胞凋亡。
2 糖皮质激素反应的细胞机制
从广义上而言，糖皮质激素通过基因组和非基因组的机制发挥作用（图1）。基因组的行为包括通过GR直接调节DNA转录。当糖皮质激素缺乏时，GRs残留在胞浆内、与分子伴侣结合成为多蛋白复合体。这些复合体使GRs转录失活但是具有高亲和力配体结合构象。一旦GR与糖皮质激素配体结合，GR从蛋白复合体上释放并且转运至细胞核，核内GR-GR二聚体鞥能够直接与糖皮质激素应答元件（GREs）上的DNA序列结合，GR特异性的靶向基序活化了基因转录。除了与GREs直接结合，GRs能够与其他转录因子例如AP-1、NF-κB、STAT3相互作用调节基因转录。糖皮质激素的一个显著作用是减轻炎症，能够直接活化抗炎症蛋白例如使MAPKs 去磷酸化的MKP-1以及GILZ，通过与AP-1、NF -κB等转录因子相互作用降低促炎症细胞因子以及细胞因子诱导蛋白（如TNFα、IL-1、ICAM-1）的水平，使促炎症因子的转录受到抑制。糖皮质激素通过降低促炎症细胞因子mRNA的稳定性减少其表达，假设它们与阴性的GREs (nGREs)结合抑制了转录，虽然全基因组GR结合研究并不支撑这一机制。
GR是由核受体亚家族中的NR3C1基因编码，能够产生两个剪接突变体GRα以及GRβ。每个GR mRNA突变体也具有一组翻译起始位点能够导致多个GR翻译异构体。GRα剪接突变体作为经典的GR蛋白，能够介导糖皮质激素的作用。GRβ具有一个不完整的配体结合结构域，因而不能结合糖皮质激素。然而，GRβ与GRα共表达竞争GREs时作为负向抑制剂发挥作用，而GRα-GRβ异二聚体拮抗GRα-GRα对响应糖皮质激素基因的功能。在一些细胞中GRβ的水平升高并且GRα:GRβ的比率降低与糖皮质激素耐受相关，表明GRβ可能是糖皮质激素应答的一个生物标记物。GR自身的活性受一些因子的调节，包括翻译后修饰例如特定氨基酸的磷酸化将会改变其在基因转录中的功能。
已知的糖皮质激素引起凋亡的基因机制包括编码促凋亡蛋白的基因表达升高，破坏线粒体膜电位，导致caspase 9-和caspase 3诱导的细胞凋亡。另一凋亡的机制是在发育的T细胞中，GRs转运至线粒体，与BCL2家族中促凋亡的蛋白相互作用。糖皮质激素影响B细胞、T细胞、巨噬细胞以及嗜酸性粒细胞的凋亡，而在乳腺上皮细胞、卵泡细胞、肝细胞及一些肿瘤中具有抗凋亡的效应，并且对糖皮质治疗并不响应。这些细胞类型特异性的差异可能是由于BCL2家族促凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡差异导致的。
糖皮质激素的一些基因组作用发生迅速，在糖皮质激素暴露10分钟后气道上皮细胞的转录发生巨大的变化。此外糖皮质激素能够在数秒内通过非基因组应答引起细胞内钙离子动员、肌肉反应性以及活性N/O物种的变化，可能在哮喘治疗中发挥作用。这些非基因组的效应可能通过以下途径发生：1）与细胞膜非特异性结合；2）与细胞溶质中GRs相互作用；3）与膜相关GRs之间的相互作用。
1） 糖皮质激素分子嵌入细胞膜并且相互作用影响离子转运，例如支气管上皮细胞暴露于地塞米松后基底Ca2+水平在30s内降低，该过程并不受GR拮抗剂RU486或者蛋白合成抑制剂放线菌酮的作用，提示存在非基因组的GR非依赖的机制。另外，通过糖皮质激素诱导的Ca2+快速降低受Ca2+-ATP酶泵抑制剂、一个腺苷酸环化酶的抑制剂、一个蛋白激酶抑制剂的抑制作用，提示AC/PKA信号通路调节钙离子流的变化。
2） 暴露于高剂量糖皮质激素的血管内皮细胞中，PI3K/Akt信号通路迅速升高，导致NO和内皮NO合成酶(eNOS) 的活化，导致血管舒张。eNOS活性的升高在糖皮质激素暴露10分钟后显著，并且通过GR拮抗剂RU486、一个PI3K抑制剂以及一个eNOS抑制剂废除，而不是通过一个转录抑制剂，提示细胞质GRs的非转录效应介导血管舒张。
3） 细胞膜结合的GRs能够独自或者与GPCRs相互作用活化下游的信号通路。在糖皮质激素膜不可渗透的CCRF-CEM细胞中，与细胞死亡和凋亡相关的蛋白表达在5min时发生变化，并且通过原位邻近连接试验证实细胞表面膜结合GR的存在。原位邻近连接试验和免疫印迹的结果证实在A549、U2OS以及MCF-7细胞中一些GRs通过与Cav-1相互作用与膜结合。在人类气道平滑肌(ASM)细胞中发现膜结合GRs能够通过糖皮质激素介导cAMP的快速产生，皮质醇以及BSA结合的皮质醇同样导致cAMP水平的升高。敲除编码G蛋白Gαs的基因GNAS能够消除这种效应，提示膜结合GRs与GPCRs相互作用调节cAMP水平。
在细胞水平，多个机制与糖皮质激素应答的差异相关。在严重哮喘患者的外周血单核细胞以及肺泡巨噬细胞中p38 MAPK活化的GR磷酸化升高将会导致GR核转运降低。在ASM细胞中也观察到GR转运的减少，是由于高水平的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶5（PP5）导致GR磷酸化受损。另一机制是核内HDAC2的活性减低改变了炎症基因的表达。
图1. 糖皮质激素的作用机制。GRs以多蛋白复合体的形式存在于细胞质中。GRs与糖皮质激素结合后，被释放和装运至细胞核内，通过直接与DNA序列或者其他转录因子直接相互作用，导致抗炎症和凋亡的效应。糖皮质激素在一些信号通路中非特异性的与细胞膜、胞质中GRs以及膜上GRs相互作用激发非基因组效应。糖皮质激素在一些信号传导过程中发挥非基因组效应，通过与细胞膜、细胞质GRs和膜结合GRs的非特异性相互作用。AC:腺苷酸环化酶:Akt:蛋白激酶B:ATP:三磷酸腺苷:BCL2: BCL2细胞凋亡调节:Bcl-xL: BCL2像1:BIM: BCL2，如11:不好的:BCL2相关激动剂细胞死亡:cAMP:环磷酸腺苷:Cav-1: caveolin-1:DUSP1:双特异性磷酸酶1:cGR:胞质糖皮质激素受体:eNOS:内皮一氧化氮合酶:GPCR: G蛋白偶联受体:格:糖皮质激素受体:G:刺激G；蛋白质:细胞间黏附分子-1:il - 1:白介素1:MAPK: mitogenactivated；蛋白激酶:mGR:膜结合糖皮质激素受体:PI3K:磷酸肌醇3-kinase:PKA:蛋白激酶A:PKC:蛋白激酶C:Src:原癌基因；酪氨酸受体激酶Src:TF:转录因子:TNF(肿瘤坏死因子):TNF(肿瘤坏死因子)TSC22D3：TSC22域名家族成员3。
3 药物基因组学：基因突变体影响糖皮质激素反应
糖皮质激素药物基因组学研究面临诸多挑战：难以收集足够多且具有明确药物反应表型的病人数据、选择合适的预后、在研究中利用相同的预后检测普遍性以及确保患者在服用药物时能达到预期的效果。在哮喘中糖皮质激素药物基因组学研究以吸入皮质类固醇（ICS）的患者为基础设置多个时间进程，以哮喘发作的次数以及肺功能的改善作为预后。这些队列中包含临床试验中经历洗脱期和仔细检测药物使用情况的受试者，而其他的研究包括不同程度疾病严重性以及无药物依从性的数据。
对糖皮质激素应答早期基因组学研究聚焦于NR3C1基因的单核苷酸多态性(SNPs)。与糖皮质激素应答相关的NR3C1多态性包括功能突变体N363S(rs56149945)、ER22/23EK（rs6189和rs6190）以及基因内的突变体rs41423247 (aka BclI多态性)。N363S以及ER22/23EK首次通过NR3C1基因聚合酶链反应/单链构象分析在一项基因相关研究中通过地塞米松抑制检测发现20个健康个体应答降低确定。BclI多态性的载体最初通过DNA限制酶BclI的消化确定，N363S的载体在应答糖皮质激素时敏感性升高，而健康个体中ER22/23EK载体的敏感性降低。除了地塞米松抑制检测的基因研究结果外， 在所有ALL病人中只有与糖皮质激素的治疗应答显著相关的NR3C1 SNP是BclI多态性的。这些候选基因的关联性在随后全基因组分析研究GWAS中并未观察到。
在哮喘病人中与糖皮质激素应答相关的位点通过GWAS确定。Tantisira及其同事对181例白人哮喘原发病患以及4个独立的临床试验群体的ICS应答进行了GWAS研究。在发现阶段13个最大的突变体选择性复制，靠近糖皮质激素诱导1(GLCCI1)的rs37972 SNP在名义上唯一相关(P <0.05)。功能分析发现B细胞中与rs37972高度连锁不平衡的SNP rs37973与GLCCI1的表达降低相关，表明rs37973通过改变GLCCI1的表达降低糖皮质激素应答。在一些独立研究中并不能重复CLCCI1的相关性。GWAS将189例患有哮喘的韩国人在四周ICS治疗后FEV1比例的变化定义为ICS应答，结果发现SNPs最高的能够与尿囊酸酶(ALLC)匹配（P <10-6），将这一群组哮喘症状的变化值作为预后，确定了靠近RMST的三个SNPs：LINC02140、F-box以及FBXL7。随后对120名随机哮喘病人进行剂量依赖的GWAS分析，建立对ICS剂量依赖应答的模型。研究者确定了5个与肺功能以及哮喘风险相关的代谢基因，其中三个在全基因组学中显著（p <5×10-8），表明药理学模型提高了检测潜在关联的统计能力。截至目前，已经发表的有关ICS应答最大的GWAS分析将8-12周FEV2的变化定义为ICS应答，利用2675个哮喘患者数据分析发现没有基因突变体能够满足预先设定的全基因组显著性统计标准。尽管这项研究发现GLCCI1突变体与FEV1的变化名义上相关，主要的结果表明在哮喘中普遍存在的基因突变体不能作为类固醇应答的生物标记物。
在一些群体研究以及生物库中糖皮质激素应答GWAS分析没有纵向肺功能的相关数据，这些数据通常以特定时间哮喘发作的次数作为预后。在两个生物库GWAS分析中研究者确定了CMTR1的SNP与发作风险升高相关。第一个也是最大的ICS应答的GWAS研究在1347个经ICS治疗的儿童中进行，元分析发现APOBEC3B和APOBEC3C显著。
有关糖皮质激素副作用与基因突变体关联也进行了GWAS分析。为了解释哮喘儿童长期、间歇口服皮质类固醇将会导致骨矿物质积聚显著减少，一项GWAS将CAMP实验组中489名儿童中多发性口服皮质类固醇与骨密度相关联分析，结果发现两个SNPs：TBCD和TUBG1与BMA相关，BMA的降低与强的松剂量的升高显著相关，因为这两个SNPs中的风险等位基因数目从0升高至3。近期的研究通过对499名哮喘儿童进行发现GWAS分析鉴定了参与ICS诱导肾上腺抑制突变体，并且试图在81例哮喘儿童和78例COPD成人中重复验证。血小板衍生生长因子D (PDGFD)附近的单个基因座与肾上腺抑制显著相关。
在ALL患者中，通过GWAS鉴定糖皮质激素治疗后与副作用相关的突变体。骨坏死是儿童ALL缓解-诱导治疗前两年糖皮质激素的主要副作用。糖皮质激素诱导骨坏死的GWAS分析发现GRIN3A和ACP1突变体与骨坏死的风险升高相关。因为地塞米松更大的抗白血病的效果使其已经成为ALL治疗中首选的糖皮质激素，研究者试图鉴定能够导致地塞米松副作用的基因突变体以指导临床实践。近期391例ALL患者14个多效表型间关系的GWAS分析发现F2RL1位点具有骨坏死、血栓形成以及地塞米松治疗的副作用等多效效应。这些相关性可能需要进一步验证糖皮质激素的敏感性以及ALL治疗中糖皮质激素可能诱导的副作用。
通过GWAS将基因突变体与糖皮质激素应答的机制相联系充满挑战。这种突变体以及那些与哮喘和ALL相关的突变体可能影响GR的表达或者它的一级或者二级靶基因。例如，哮喘相关肿瘤坏死因子TNFAIP3是GR的靶基因和GR信号通路的关键调节因子，在哮喘联合长效的β2激动剂时糖皮质激素诱导的表达进一步增强。TNFAIP3与哮喘之间的关联可能反映了对糖皮质激素应答相关信号通路的影响。
4 转录组学和表观遗传学：细胞类型特异基因表达及糖皮质激素受体的调节
对转录组或者系统中RNA表达的测量可以通过技术捕获，例如基因表达微阵列以及RNA-seq。在人类和体外模型中对糖皮质激素应答的转录组学研究已经在多个细胞和组织类型中进行，包括巨噬细胞、ASM来源的原代细胞以及气道上皮细胞，同样也包括转化的细胞系例如ALL、类淋巴母细胞人乳腺上皮细胞系MCF10A-Myc以及骨肉瘤细胞。ChIP-Seq是一种在全基因组范围内衡量转录因子结合位点的表观遗传学技术。大多数GR ChIP-seq研究整合了相同条件下转录组学和ChIP-seq的数据，因为1）转录组数据有助于鉴定GR结合的差异表达的靶基因；2）ChIP-seq的结果可能用于区分GR的下游靶基因，RNA聚合酶II的ChIP-seq结果可以确定活化的转录因子结合位点。近期的GRO-seq技术能够直接检测新生的转录，并且提供了更直接的证据说明某个位点正在进行mRNA转录。其他应用于研究糖皮质激素应答的数据包括1）STARR-Seq通过将ChIP片段克隆岛转录本报告基因鉴定GR结合位点上增强子的能力；2）DNase I高敏感位点测序(DNase-Seq)能够测定开放染色质的结构；3）Hi-C能够测定染色质相互作用的拓扑结构。
与糖皮质激素的基因行为——直接调节基因转录一致，转录组学研究能够快速鉴定糖皮质激素诱导基因表达的改变，地塞米松是转录组学研究中最常用的合成型糖皮质激素，尽管有些在临床上使用强的松和布地奈德。虽然不同的糖皮质激素可能具有不同的作用，转录组学研究发现暴露在不同的糖皮质激素中细胞应答相似。哮喘相关转录组学研究大多聚焦于气道的结构细胞。早期微阵列研究探究了地塞米松对ASM细胞的效应并且确定了转录因子KLF15是一种新型的气道高反应调节因子。KLF15相关功能学研究发现其实GR结合位点上的主要靶基因，并且GR与KLF15之间的相互作用有助于转录的共调节，例如编码氨基酸代谢酶的基因。
RNA-seq研究比较了捐赠者来源ASM细胞中布地奈德处理与对照组转录组的变化，捐赠者没有任何慢性疾病，结果发现成千上万差异表达的基因，包括CRISPLD2、CEBPD。从致命哮喘供体中提取的ASM细胞在体外保留增殖和收缩预后的差异，表明它们对糖皮质激素的应答不同于没有哮喘的捐赠者。研究者近期的研究比较了致命哮喘和无哮喘捐赠者的ASM细胞对布地奈德响应的转录组变化，结果却发现依据哮喘的状态，响应糖皮质激素的基因表达图谱并没有不同。尽管在ASM细胞中转录组的变化是一致的，7个细胞类型的整合分析发现，只有两个熟知的糖皮质激素应答基因FKBP5以及TSC22D3在ASM细胞、儿童ALL细胞、巨噬细胞、类淋巴母细胞以及U2OS中水平升高。其他糖皮质激素响应基因，如PER1、KLF15以及CRISPLD2在部分细胞中表达升高。这些结果说明一些细胞类型特异性的糖皮质激素应答发生在基因表达水平。考虑到糖皮质激素暴露鉴定的大量差异表达基因，单独基于转录组学的数据进一步研究优选的基因是非常困难的。
在人类转录组中对糖皮质激素应答也有研究。在一项对轻度哮喘患者口服强的松龙2周效果的调查中利用RNA-seq对支气管镜检样本中分离得到的ASM进行分析。分别将6个患者进行糖皮质激素处理和安慰剂处理，通过比较发现两组中15个基因显著差异表达，FAM129A和SYNPO2家族也与气道高度反应相关。相对于体外研究，该研究鉴定的基因数目较少，可能是由于通过激光捕获ASM困难，且测序深度低。将哮喘病人接受10周吸入氟替卡松或者安慰剂的气道上皮转录组进行比较，结果发现氟替卡松治疗组CLCA1、POSTN、 SERPINB2的表达降低。另一项研究对健康男士接受吸入布地奈德与安慰剂处理后气道上皮细胞转录组的变化进行比较，确定了与体外ASM研究一致的差异表达的基因，包括TSC22D3， PER1， KLF15， DUSP1， FKBP5， CEBPD， CRISPLD2。
对所有细胞转录组研究鉴定了与气道结构细胞明显不同的糖皮质激素应答基因。早期转录组研究比较了173个ALL儿童的松龙耐受和松龙敏感的ALL细胞表达的差异，结果发现抗凋亡基因MCL1的表达增加而一些转录相关的基因表达降低如CTCF。比较13名儿童ALL患者在糖皮质激素处理前后转录组的数据，结果发现与凋亡信号通路相关BCL2家族的基因差异表达：糖皮质激素处理后促凋亡的基因BIM表达升高，而抗凋亡的基因BCL2表达降低。ALL中其他糖皮质激素应答的基因包括肿瘤抑制基因TXNIP、锌指蛋白ZBTB16以及PFKFB2。对这些基因进行后续研究发现PFKFB2并不是糖皮质激素抗白血病效应的重要调节因子，因为它在人类T细胞淋巴细胞白血病细胞系中过表达，但是对糖皮质激素诱导的细胞凋亡影响不大。通过整合转录组数据以及全基因组RNA干扰筛选，近期对B细胞前体ALL细胞的研究证实糖皮质激素能够改变凋亡相关基因的表达，例如BCL2、BCL2L11、TXNIP、ZBTB16以及B细胞发育的基因。与凋亡相关ALL特异的转录特征在所有的研究中都是一致的，但是进一步的工作需要确定哪些特异的基因可以作为糖皮质激素应答的生物标记物或者新的药物靶向。
一些GR ChIP-seq研究已经应用肺上皮A549细胞，包括早期ChIP-seq和RNA-seq研究鉴定出的GR靶基因。这项研究的重要发现有：1）应答地塞米松时有多于差异表达基因的GR结合位点；2）234个差异表达的基因中70%具有GR结合位点，并且超过基因转录起始位点10kb；3）基因的GR结合位点表达降低时距离TSS中位距离为100kb，远大于基因表达升高的距离。随后利用ChIP-seq和DNase-Seq数据鉴定了A549和人类子宫内膜来源的ECC1细胞之间共有的和细胞类型特异的GR结合位点，结果发现只有一小部分的结合位点是共有的。大多数细胞类型特异的GR结合位点缺少GREs，并且在糖皮质激素治疗之前处于染色质开放区域，而共有的GR结合位点更有可能具有GREs。依据对A549细胞的STARR-Seq研究，只有13%GR结合位点具有地塞米松诱导活性，80%的位点具有一个GRE。将GRE引入无响应的GR结合位点能够显著提高增强子的活性，这使得作者猜想无响应的GR结合位点通过与GREs远端相互作用调节基因表达。近期Hi-C研究发现GR结合发生在前期建立的染色质相互作用，而不是暴露在糖皮质激素后，支撑了模型：成环的GR结合位点通过现有染色质结构调节基因表达。
研究者在气道结构细胞中进行了ChIP-seq，致力于通过糖皮质激素激发哮喘相关疗效来鉴定GR的靶基因。为了探究糖皮质激素诱导GR与NF-κB之间的相互作用，研究者在地塞米松、TNFα或者两者共同处理的人类上皮Beas-2B细胞中进行了GR、p65以及RNAP2的ChIP-seq。研究者发现GR招募p65使基因组内GR结合位点二聚化，GR-p65之间的相互作用提高了抗炎症和损伤应答基因的表达，例如SERPINA1、FOXP4。与之前的报道一致的是，研究者也确定了GR-p65协同结合在编码NF-κB、IRAK3、TNFAIP3基因上。然而Kadiyala等人利用小鼠骨髓源性巨噬细胞的ChIP-seq研究发现糖皮质激素活化了NF-κB负调控因子的转录活性，从而直接抑制了其功能，而不是通过GR-p65共同抑制促炎症基因的表达。为了进一步理解GR如何和NF-κB相互作用抑制细胞因子，Sasse及其同事利用GRO-seq将10min和30min糖皮质激素处理或者TNFα暴露后BEAS-2B细胞的新生转录，同时在鉴定的增强子上进行MNase可及性试验以衡量染色质的可及性。10min后糖皮质激素能够抑制TNFα诱导增强子的活性。在与GR结合峰重合的增强子中，GR抑制的增强子能够提高染色质的可及性，但是在10minGR占据并不显著，提示GR的早期抑制通过直接的核小体间的可及性发生。NF-κB的负调控因子如TNFAIP3暴露糖皮质激素30min后转录升高而蛋白表达水平不变，提示第二次抑制是由于GR和NF-κB协同转录诱导的基因效应。同样进行ChIP-Seq研究以探究哮喘相关的候选基因，包括KLF15对ASM糖皮质激素应答的效应，结果发现PLCD1是KLF15的靶基因并且是ASM肥大的抑制因子。
5 蛋白组学和代谢组学：鉴定糖皮质激素应答的下游生物标记物
蛋白组学和代谢组学的方法提供了一个细胞或者组织中的一些蛋白和代谢物的快照，反应了更接近基因组、转录组或者表观组的的物理状态。蛋白组学和代谢组学并不能完全无差别，因为特异物种蛋白和代谢物的鉴定依据数据库将测量的光谱与之联系，在一个系统中并不能同时测量所有的蛋白或者代谢物。然而，蛋白组学和代谢组学具有巨大的潜能，为生物标记物的发现、疾病的表型以及疾病和药物反应机制研究中靶向的鉴定提供帮助。一些基于利用糖皮质激素的哮喘患者进行的蛋白组学研究致力于寻找应答反应的生物标记物。通过比较布地奈德或者安慰剂的哮喘患者支气管内活检的蛋白水平，在一项研究中确定了代表急性期应答通路的蛋白特征。该条信号通路同样在鼻分泌液蛋白质组差异的两项研究：1）间歇性鼻炎在氟替卡松治疗前后2）季节性鼻炎患者对氟替卡松应答的高低中发现。载脂蛋白H(apoH)是最具有前景的候选生物标记物，对应急性期应答通路，在氟替卡松治疗后的病人中水平降低，特别是具有最大临床反应的患者。研究者利用DIGE和MS方法，通过比较6个类固醇抗性哮喘患者与6个类固醇敏感哮喘患者确定了7个差异表达的蛋白。在这些蛋白中，类固醇抗性哮喘组中VDBP增加最大，血清中VDBP的水平与中性粒细胞和单核细胞高度相关，提示VDBP可区分临床上应答糖皮质激素的哮喘患者。一项体外蛋白组学研究试图利用高分辨率的MS探究地塞米松引起的蛋白表达变化，将健康个体来源的外周血单核细胞分别暴露在：1）载体对照；2）炎症因子1小时；3）炎症因子1小时后地塞米松处理3小时，研究者发现熟知的促炎症因子，例如IL-1β、IL-6、CXCL2、GROα、PTX3 以及TSG6在暴露在炎症因子后表达升高。暴露在地塞米松后一些蛋白（IL-1β， IL-6， CXCL2， GROα）的水平降低，而其他的蛋白（PTX3， TSG6）仍然不变。这些蛋白组学研究提供了有关药物应答生物标记物的假说，可以被预先检测或者作为机制研究的候选者。
对糖皮质激素抗性或者敏感的细胞系进行蛋白组学研究可以获得其他候选的生物标记物。一项研究比较了4种临床相关白血病细胞系强的松龙治疗前后蛋白组学的变化，在糖皮质激素敏感的细胞系中鉴定出了77个显著差异表达的蛋白，在糖皮质激素耐受的细胞系中鉴定出了17个。在这些蛋白中，PCNA在糖皮质激素敏感的细胞中表达降低，并且在43对新诊断儿童ALL患者以及强的松龙治疗7天后的骨髓样本中验证。PCNA能够高度预测强的松龙应答而不依赖于病人的分子表型，提示可将其作为一个普遍的预后标志物。另一项利用基于MS方法比较了糖皮质激素敏感细胞PreB 697以及糖皮质激素耐受亚克隆R3F9暴露在地塞米松或者载体对照时的蛋白组，结果发现对B细胞发育非常关键的转录因子PAX5在糖皮质激素耐受细胞系中的表达显著降低，而它的靶基因CD19保持不变。
将CCRF-CEM细胞利用BSA耦联皮质醇或者对照处理5、15、90分钟，比较细胞胞浆和细胞核部分的蛋白，结果发现通过膜结合GR活化的蛋白对细胞死亡和凋亡信号通路是特异的。这些蛋白表达的改变不依赖于GR活性：皮质醇能够诱导胞浆GR靶基因GILZ的表达，但是BSA耦联的皮质醇刺激后保持不变。因为糖皮质激素非基因组效应同样受蛋白翻译后修饰的调节，未来聚焦于蛋白修饰的磷酸蛋白组学研究可能会使我们深入了解非基因组启动与基因组糖皮质激素应答相关的其他机制。此外，这些研究可能揭示了在哮喘患者和非哮喘患者中糖皮质激素反应的差异。
代谢组学已经应用于预测糖皮质激素的细胞反应和副作用。一项研究比较了20例成人男性在接受4 mg口服地塞米松前后血浆中的代谢物。从1到7天每天三个预设的时间点提取样本，并且第三天进行地塞米松处理。总之，从每个志愿者中获取7个未处理的和4个处理的样本并进行MS。利用ANOVA模型，研究者发现150/214的代谢物在治疗后至少一个时间点发生显著变化，证实地塞米松对昼夜节律有影响：地塞米松处理前后皮质醇和皮质酮的水平早晚波动。并且处理后皮质醇和皮质酮的水平在所有时间点显著下降。除了其他内源性类固醇的抑制，其他代谢改变反应了改变的能量相关信号通路、脂类分解以及肌肉蛋白水解，这些可能与糖皮质激素副作用相关。另一代谢组学利用地塞米松以及对照生理盐水注射14周的大鼠，结果发现地塞米松处理大鼠中代谢物的改变与表型的变化一致。例如，血浆中氨基酸的改变可能与体重降低以及骨形成减少相关，而山梨醇水平的升高与高血糖有关。这些研究提示不同的代谢物可作为糖皮质激素诱导副作用的潜在生物标志物。
为了理解糖皮质激素诱导ALL细胞死亡中代谢重编程的作用，最近的一项研究检测了人类ALL RS4细胞的代谢图谱，11个细胞暴露在地塞米松进行基于MS的蛋白组学、代谢组学和同位素追踪试验。糖皮质激素暴露导致的代谢改变与生长停滞、自噬以及凋亡起始之前分解代谢，例如: 新生嘌呤合成和多胺合成减少、脂肪酸和甾醇合成减少以及脂肪酸氧化的增加相关。糖皮质激素也能抑制葡萄糖和谷氨酰胺进入柠檬酸循环(TCA)循环。相反，糖皮质激素使谷氨酰胺-氨连接酶(GLUL)和细胞中谷氨酰胺表达增加，提示谷氨酰胺合成在应答糖皮质激素的自噬和凋亡中发挥作用。很少有代谢组学研究关注哮喘患者的糖皮质激素应答，而且已经发表的大多数报道都基于小的样本且缺乏全面的论证。然而这些研究都阐述了它们的潜能，包括与脂肪和氨基酸代谢相关代谢物与哮喘的严重性以及吸入皮质类固醇剂量相关，与转录组研究基因表达图谱一致。组学研究中的发现反应了糖皮质激素的
结论
组学的方法能够无差别的测量生物系统中多层面的信息并且已经应用于揭示生物医学的大量问题，包括肺部疾病和糖皮质激素反应：药物基因组学已经探究了病人应答糖皮质激素过程中的遗传决定因素；转录组和表观基因组学研究也衡量了细胞类型特异性的转录变化并将其与DNA结合的转录因子联系；蛋白组学和代谢组学探究了反应糖皮质激素应答的下游生物标记物。在本文中研究者概述了组学方法的应用以更好的了解糖皮质激素的反应。
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