【IDseq™ Ultra原理解析】当病原宏基因组(mNGS)遇上探针捕获
常规病原宏基因组检测技术（mNGS）面临样本类型与潜在病原多样、检测分析背景嘈杂的困境，高效去宿主技术是精准检测的核心秘籍之一。对于下呼吸道样本，通过反向富集技术，可以很好地降低宿主占比，显著提高病原菌检测灵敏度[1]。
而目前对于人源背景极高的样本类型如血液，常规mNGS检测采取全血离心，对血浆层游离DNA进行检测[2]，存在丢失胞内菌、真菌等潜在病原的风险。
图1. 提高mNGS病原体检测灵敏度的两种方式
正向富集 & 反向富集
因此，面对不同的样本类型，常规mNGS检测缺乏普适的去宿主技术，我们需要更灵敏、更全面的病原体检测技术，进一步满足临床精准诊断的需求。
IDseqTM Ultra，基于mNGS和探针捕获的双向富集技术，应运而生，具有全面、高敏、深入的技术优势，适用全样本类型，可提高100X信号灵敏度，持续为感染性疾病诊断赋能。
什么是探针捕获？
定义：通过设计合成靶向目标区域（人基因组或微生物特定区域等）的特异性探针，与样本中含有靶标区域的目标基因组文库DNA进行杂交，捕获后使用主流的测序平台进行高通量测序。
流程：样本核酸提取后构建高通量测序文库，加入根据靶向区域设计的捕获探针。探针可部分或全部与目标区域互补，使用磁珠捕获探针，利用磁性“抓取”目标序列，随后洗脱未捕获区域，从而实现正向富集（图2）。
图2 探针捕获流程示意图
探针捕获应用进展[3a]
（1）人类基因组
最初探针捕获用于人全外显子靶向测序。随着技术的提升，研究者将探针捕获应用于染色体疾病、线粒体疾病的基因诊断。目前，探针捕获已广泛应用于肿瘤的早期筛查。
（2）古基因组研究
为应对基因组高度片段化和背景DNA污染的困境，研究者使用探针捕获技术排除背景干扰，富集碎片化的目标片段，研究古人类的线粒体DNA或Y染色体DNA、高毒力鼠疫耶尔森菌的基因组等。
（3）人类感染性疾病病原体检测
针对细菌如结核分枝杆菌、真菌如白色念珠菌、病毒如人类疱疹病毒3型（VZV）、寄生虫如恶性疟原虫等各类病原，探针捕获均具有较好的病原富集效果，展现出巨大的临床应用潜力。
超多重病原靶向检测:探针捕获脱颖而出
面对多个病原的一次性快速检测需求，多重PCR后高通量测序是另一种常规靶向检测的方法。该技术通过设计特异性结合目标区域的多对PCR引物，在一个体系中进行多靶标的PCR反应，进而实现显著富集目标序列[4]。
表1 靶向富集方法比较
然而，当面对超多重病原靶向检测需求时，因引物数量存在上限等因素，探针捕获技术脱颖而出，更适用于宏基因组检测中病原的靶向富集，具体细节见如上对比（表1）。
探针捕获赋能mNGS病原检测
探针捕获病原体覆盖广泛，与无偏性的mNGS强强联合后具备如下优势：
全面
● 不惧人源背景干扰，实现全血检测，保证布鲁杆菌等胞内菌和真菌的检测性能；
● 可覆盖数千种临床可报重要病原体；
● 探针设计兼顾包容性，避免遗漏新病原/新毒株。
高敏
正向放大目标病原信号，实现病原体高敏检出，可显著提高无菌体液检出阳性率；
深入
进一步提高病原分型能力，具备高于常规mNGS的耐药/毒力分析能力，涵盖临床重要细菌如结核的点突变耐药基因。
从文献透析IDseqTM Ultra应用场景
Gaudin等[3b]于2018年发表了“基于探针捕获的靶向测序及其在人类感染性疾病中的应用”综述，回顾了2011-2018年，共29项使用探针捕获关注感染性病原体的研究，包括全血、尿液、组织切片等多种生物样本，覆盖细菌、真菌、病毒、寄生虫多类型病原。通过归纳各研究结果，作者总结出探针捕获靶向测序在面对人类感染性疾病的四个应用场景（图3）。
图3 靶向测序的流程，及其在感染诊断中的应用
场景1：病原检测
检测目标病原，尤其低丰度（低拷贝数）和或混合多样的病原微生物；
场景2：病原耐药基因/毒力因子鉴定
检测病原微生物基因组上的耐药/毒力基因，指导临床治疗；
场景3：病原鉴定
流行病分析如病原株系分型与系统发育分析等；
场景4：病原基因组特征探究
基因组发生的变异（INDELs），可移动遗传元件的鉴定。
总 结
探针捕获技术与mNGS相结合，可以提高病原检测灵敏度，解决高人源背景样本检测难的痛点，是感染精准诊断又一利器，未来期待其在临床发挥诊断优势，服务医患。
我们深深明了
每一份珍贵样本的背后
都有一位亟待救治的病患
基因科技，无微不至
参考文献
[1] Nelson MT, Pope CE, Marsh RL, et al. Human and Extracellular DNA Depletion for Metagenomic Analysis of Complex Clinical Infection Samples Yields Optimized Viable Microbiome Profiles.[J]. Cell reports, 2019.
[2] Blauwkamp TA, Thair S, Rosen MJ, et al. Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease[J]. Nature Microbiology. 2019.
[3a-b] Gaudin M, Desnues C. Hybrid Capture-Based Next Generation Sequencing and Its Application to Human Infectious Diseases[J]. Frontiers in Microbiology, 2018.
[4] Mamanova L, Coffey AJ, Scott CE, et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing[J]. Nature Methods, 2010.