科研 | 中国药科大学：多组学分析揭示UV-B辐射诱导丹参合成SalA的机制（国人佳作）
编译：寒江雪，编辑：Tracy、江舜尧。
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丹酚酸（SalA）是丹参中的次生代谢物，在治疗心脑血管疾病中广泛应用。它的生物合成受到紫外线-B(UV-B)辐射在内的多种非生物因素的调节，然而，其潜在的分子机制仍不清楚。本研究将代谢组学、蛋白质组学和转录组学相结合，再结合转基因来分析UV-B辐射诱导SalA生物合成的机制。代谢组学结果表明，经UV-B处理的丹参叶片中有28种代谢物含量升高，其中包括12种SalA；同时，UV-B处理丹参后茉莉酸和水杨酸等几种正向调节SALA生物合成的激素含量也有所增加。联合蛋白质组分析表明，参与SalA生物合成的20种核心生物合成酶和大量转录因子在处理组中持续升高，编码NAC转录因子的NAC1基因参与了UV-B诱导的SalA生物合成，因此，NAC1的过表达和RNA干扰分别通过调节关键的生物合成酶增加和降低了SalA的含量。此外，ChIP-qPCR和Dual-Luc分析表明，NAC1可以直接与SALA生物合成相关基因PAL3和TAT3启动子中的CATGTG和CATGTC基序结合，并激活它们的表达，本研究表明NAC1在UV-B辐射诱导的SALA生物合成中起着至关重要的作用。综上所述，本研究的发现为研究UV-B诱导丹参合成SalA的机制提供了理论依据，并为通过基因工程培育富含SalA的品种提供了巨大的潜力。
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实验设计
实验结果
1. UV-B辐射诱导丹参合成SalA合适的时间
丹酚酸B含量常用于评估丹参的质量。为了选择适合丹参的UV-B辐射条件，我们采用300uW·cm-2的推荐剂量，对中(4h)和长(16h)UV-B辐射后的植株表型和丹酚酸B含量进行了分析，发现UV-B处理4 h后正常生长，16 h后几乎死亡（图1a）；丹酚酸B在UV-B照射4 h后高度增加，处理16h时略有增加（图1a），因此，我们选择了UV-B辐射0（对照）和4h（UV-B处理）的丹参，进行进一步的生理、生化和分子研究（图1b）。
图1 实验设计的示意图
a 用UV-B辐射3月龄丹参植株0、4、16h，测定叶片中丹酚酸B含量的变化。b 选择UV-B辐射0和4h的丹参植株进行代谢组学和蛋白质组学分析。
2. 代谢组学分析检测UV-B辐射下丹参中SalA含量变化
为了确定UV-B辐射诱导产生的所有SalA的含量，我们对UV-B辐射0h(对照)和UV-B辐射4h的丹参植株叶和根进行了代谢组学分析(图1b)。代谢组学结果表明，UV-B辐射的叶或根获得的总离子色谱图与对照样品差异显著。在经UV-B处理的丹参的叶和根中，我们分别鉴定出有38种和18种代谢物的水平发生了变化（图2a）。通过本实验室构建的SalA文库和已发表的文献进一步分析，我们发现丹参叶片和根中分别增加了12个和9个SalA（表1）。UV-B辐射显著提高了丹参叶和根中主要SalA的含量，如丹酚酸B、迷迭香酸和丹参素(图2b)。13(S)-氢过氧亚油酸[13(S)-HpOTrE]、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)在SalA生物合成中同样发挥了重要作用，它们的含量在叶片中也显著变化。
图2 UV-B处理对丹参叶片和根中SalA含量的影响
a 叶和根中鉴定出的离子、代谢物和SalA的统计结果。b 叶和根中代谢物的相对丰度。
表1 在UV-B照射下丹参叶片和根中SalA的含量变化
3. 蛋白质组学分析揭示UV-B辐射下与SalA生物合成直接相关的关键酶的变化
我们通过比较蛋白质组学结果分析探讨UV-B辐射诱导SalA生物合成的机制，对UV-B处理过和对照的叶片和根用iTRAQ蛋白质组学方法进行分析，再通过测定获得的所有多肽长度和唯一多肽的数量来评价蛋白质组数据的质量。我们在叶子和根中分别鉴定到16830和21120条肽,置信水平为95%,分别比对到3303和3620个蛋白质（图3）。差异分析得到叶片中有281个上调蛋白，155个下调蛋白；根中有102个上调蛋白和157个下调蛋白（图3a）。代谢组学分析结果可知，转酮醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PD)、烯醇化酶、3-脱氧-7-磷酸庚酸合成酶(DPS)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸转氨酶(TAT)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸：辅酶A等20种与SalA生物合成相关的关键酶的水平（图3b，表2），酶活性分析还发现UV-B辐射下丹参叶片中PAL和TAT的活性显著增强(图3c)。在UV-B处理下，丹参根系中只有PAL和TAT等5种与SalA生物合成相关的关键酶水平显著升高（表2）。
我们进一步分析蛋白质组数据，以确定UV-B辐射下丹参叶片合成SalA的调控机制，结果显示处理后的丹参叶片中，9种转录因子蛋白水平增加，包括与拟南芥同源的bHLH1, bHLH2, bHLH3,NAC1。此外，叶片中JA生物合成相关的脂氧合酶（LOX）和SA生物合成相关的PAL蛋白也显著升高（表2），说明UV-B促进了JA和SA的积累。在丹参的根中，我们只检测到两种因子，bHLH2和NAC1在UV-B辐射下显著增加（表2），UV-B辐射对丹参根系中茉莉酸生物合成相关酶水平无明显影响(表2)。
图3 蛋白质组学分析，确定在UV-B照射下参与SalA生物合成的关键蛋白
a UV-B辐射与对照组相比蛋白质组分析结果。b 6-磷酸果糖生物合成SalA的途径和对照和处理样品中的蛋白质丰度。c 对照组和UV-B辐照组的PAL和TAT酶活性。
表2 丹参叶片和根中参与SalA生物合成的关键蛋白在UV-B辐射下含量变化
4. 鉴定蛋白水平变化与SalA含量变化的相关性
在本研究中，代谢组学分析确定了12种SalA在UV-B辐射下在丹参叶片中含量升高。蛋白质组中，与SalA生物合成，转录调控，蛋白质稳态，光合作用，叶绿素合成和蔗糖代谢有关的蛋白质受到UV-B辐射的显著影响（表2）。我们通过相关性分析SalA含量变化和UV-B辐射响应蛋白之间的关系，如图4所示，根据与SalA含量的相关值，将显著变化的蛋白质分成三类。丹酚酸B和迷迭香酸的含量与簇II中的蛋白质呈正相关，例如SalA生物合成相关的蛋白质和TF，与簇I中的蛋白质包括与光合作用相关的蛋白质呈负相关，。
图4 差异表达蛋白与差异变化的SalA相关性分析
5. UV-B辐射下丹参体内SalA生物合成相关基因的表达
研究人员对TAT3、RAS3、HPPR3、PAL3、C4H2、4CL3、转酮醇酶-2，G3PD、烯醇化酶和DPS进行了基因定量分析。其中有9个基因的表达显著上调(图5a)，参与JA，SA生物合成的基因在叶片中也都显著上调，UV-B辐射也上调了编码bHLH3、NAC1、WRKY44和WRKY61转录因子在丹参叶片中的表达（图5b），证明了UV-B辐射下丹参叶片蛋白质组数据与基因表达数据之间具有良好的相关性。
图5 丹酚酸(SalA)、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)生物合成相关基因的表达分析及转录调控
a SalA生物合成相关基因的表达。b 编码显著差异表达的转录因子(TF)的基因的表达。
6. NAC1在SalA生物合成中的作用
NAC1在UV-B辐射下在丹参叶片中表达上调最高（图5b），表明NAC1可能在UV-B处理下在SalA生物合成中起关键调节作用。为了证明这一假设，我们用带有Flag标签的NAC1过表达质粒的农杆菌(NAC1-OE)、有绿色荧光蛋白（GFP）的NAC1-RNAi质粒（NAC1-SI）的农杆菌来过表达和沉默NAC1基因。PCR证实NAC1-OE质粒在毛状根中存在，我们通过检测GFP信号证实NAC1-SI质粒在毛状根中的存在(图6a)。RT-qPCR结果证实NAC1基因在丹参毛状根中成功过表达或抑制(图6b)，此外，我们使用抗-Flag一抗的Westernblot证实了NAC1蛋白水平增加(图6c)。
为了鉴定NAC1调控基因，我们对NAC1-OE、NAC1-SI和对照品系的毛状根进行了转录组测序分析。SalA生物合成相关基因，包括转酮醇酶-2、烯醇化酶、PAL3、TAT3和4CL3，在NAC1-OE毛状根中上调，而在NAC1-SI毛状根中下调；PAL2在NAC1-OE毛状根中显著上调，而在NAC1-SI毛状根中表达无明显变化。通过RT-qPCR我们检测了几个SalA生物合成相关基因在转基因毛状根中的表达水平，TAT3、PAL3、HPPR3均有表达，而在NAC1-OE和NAC1-SI毛状根中，烯醇化酶分别被显著诱导和抑制（图6b）。转酮醇酶-2和C4H2在NAC1-SI毛状根中显著下调，而在NAC1-OE毛状根中无明显变化，而DPS在NAC1-OE毛状根中显著上调，但在NAC1-SI毛状根中相对不变，聚类分析进一步证实了SalA生物合成相关基因的表达水平的变化和编码蛋白水平的变化显示出相似的趋势。我们通过相关性分析评估RT-qPCR和转录组分析中基因表达的一致性，与基因表达和酶活性数据一致，在NAC1-OE中丹酚酸B和迷迭香酸的含量高度增加，而在NAC1-SI毛状根中则急剧减少（图7a）；而与基因表达和酶活性数据一致，丹酚酸B和迷迭香酸的含量在NAC1-OE中显著增加，而在NAC1-SI毛状根中显著降低（图7b）。在这项研究中，我们选择PAL3而不是PAL2作为NAC1潜在的靶基因，因为PAL3的FPKM表达量显著高于PAL2；同时，PAL3在NAC1-OE品系中得到增强，而在NAC1-SI品系中受到抑制。在NAC1-OE中，PAL2的变化确实非常高，但在NAC1-SI品系中其表达并未受到抑制。此外，在PAL3启动子中有一个CATGTG结合位点，在TAT3启动子中有一个CATGTC结合位点，而在PAL2的启动子序列中没有CATGTG结合位点。ChIP-qPCR分析表明，NAC1可以直接结合PAL3和TAT3基因启动子区域中出现的CATGTG结合位点（图7c）,Dual-LUC分析进一步证实了NAC1激活了PAL3和TAT3的启动子（图7d）,这些结果表明这两个基因是由转录因子NAC1调节的直接下游靶标。
图6 NAC1基因的过表达或沉默影响丹参毛状根中丹SalA生物合成相关基因的表达
a 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，验证NAC1-RNAi质粒的存在。b SalA生物合成相关基因在NAC1过表达(NAC1-OE)和NAC1-沉默(NAC1-SI)毛状根中的表达。
图7 NAC1过表达或沉默对丹酚酸B和迷迭香酸含量的影响
a NAC1高表达(NAC1-OE)和NAC1沉默(NAC1-SI)毛状根的PAL和TAT酶活性。b NAC1-OE和NAC1-SI毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的含量。c NAC1-OE和对照毛状根的ChIP-qPCR分析。d Dual-LUC实验说明NAC1对PAL3和TAT3启动子激活的影响。
讨论
SalA是丹参中重要的水溶性成分，有助于治疗心脑血管疾病。本研究中，在12种增加的丹酚酸中，丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和丹参素对脑血管疾病有积极的治疗作用。适当的UV-B照射，可以增加体内SalA的含量,然而，这一现象背后的机制仍不清楚。因此，在本研究中，我们对暴露于4h UV-B辐射下的3月龄丹参植株的叶片和根进行了代谢组学和蛋白质组学分析，以期对UV-B辐射诱导该物种SalA生物合成的机制提供深入的了解。代谢组学分析结果表明，经UV-B处理的丹参叶和根中分别有12和9个SalA增加,而在对照和UV-B处理条件下，丹参幼苗叶片中增加的SalA数量高于根（图2），丹酚酸B和迷迭香酸等SalA在叶片中的积累高于根，这表明虽然SalA的生物合成发生在叶片和根中，但前者是丹参产生SalA的更敏感和更重要的组织。蛋白质组学分析表明，UV-B辐射下丹参幼苗根系中SalA生物合成关键酶的数量远低于叶片，这进一步证实了叶片是丹参营养生长期合成SalA的重要组织。鉴定经UV-B处理的丹参叶片中增加的几种代谢物可能为揭示UV-B辐射下丹参积累SalA的机制提供关键线索。随后的蛋白质组、基因表达和转基因分析(图2-7)提供了进一步的证据，使研究人员能够确定相关的关键蛋白/基因，并在分子水平上讨论UV-B诱导丹参合成SalA的机制（图8）。
图8 UV-B辐射影响丹参叶片丹酚酸积累的模型