科研| J HAZARD MATER：四环素对黑麦草生长，氧化应激反应和代谢模式的影响（国人佳作）
编译：王艳林，编辑：谢衣、江舜尧。
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论文ID
原名：Effects of tetracycline on growth, oxidative stress response, and metabolite pattern of ryegrass
译名：四环素对黑麦草生长，氧化应激反应和代谢模式的影响
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：9.038
发表时间：2019.07
通讯作者：葛世栋，米兆荣
通讯作者单位：北京大学，河南科技学院
实验设计
实验结果
1 色素含量和形态指标的变化
用光学显微镜分析了用四环素处理的黑麦草的芽和根的形态特征（图1）。如图所示，对照中的叶片中的色素含量比经四环素处理的植株中的更高。色素含量随着四环素浓度的增加而降低。叶绿素和类胡萝卜素的含量如图2所示。对照中的叶绿素含量显著高于其他组。与对照相比，用1、10和100 mg/ L四环素处理的植株的叶绿素含量分别降低了16.57％，62.17％和99.27％。类胡萝卜素含量显示出相似的趋势。与对照相比，用1、10和100 mg/L四环素处理的植株的类胡萝卜素含量分别降低了11.86％，55.13％和96.38％。对照中的叶绿素a:叶绿素b（chlo a/b）和叶绿素a:类胡萝卜素（chlo a/car）值分别显著高于用10或100 mg/L四环素处理的植株。
四环素还影响黑麦草的形态变化（图3）。它以剂量依赖性方式抑制生长（图3a）。我们测量了用或不用四环素处理的黑麦草的芽长、芽鲜重、根长和根鲜重，结果表明对照组相比用10 mg/L和100 mg/L四环素处理的植株的芽长明显增加。1、10、100 mg/L四环素处理的芽长分别比对照组短14.36％，34.96％和79.95％。100 mg/L的四环素处理比对照的芽鲜重低67.26％。对照的根长和根鲜重显著高于所有四环素处理组。1、10、100 mg/L四环素处理的根长分别比对照组短41.46％，58.77％和84.51％。1、10和100 mg/L四环素处理组的根鲜重分别比对照组低46.45％，67.06％和63.03％。
图1 黑麦草芽和根的显微照片。绿色，红色和黑色箭头分别表示可见的色素，芽尖和根尖。每组分析了九张图像。a和e，对照；b和f，以1 mg/L的四环素处理过的植株；c和g，用10 mg/L四环素处理处理的植株；d和h，用100 mg/L四环素处理的植株。比例尺，20 μm。
图2 光合色素。a，叶绿素和类胡萝卜素；b，叶绿素a:叶绿素b（Chlo a/b）和叶绿素a:类胡萝卜素（Chlo a/Car）。不同的字母表示在P <0.05时有显著差异。
图3 生长参数。a，图片；b，长度；c，鲜重。不同的字母表示在P <0.05时有显著差异。
2 ROS含量，细胞通透性和线粒体膜电位的变化
先前的研究表明，四环素可导致ROS产生增加。如图4a-e所示，与对照相比，10 mg/L的四环素处理显著促进了芽中ROS的产生。1、10、100 mg/L四环素处理的相对ROS水平分别比对照组高73.09％，94.51％和43.10％。与对照相比，四环素显著增加了根部的相对ROS水平。对照的根中的相对ROS水平比经四环素处理的植株根中的ROS水平低99％。已有研究表明高的氧化应激会影响叶绿素的生物合成。在植物细胞中，由于光合作用过程中O2浓度很高，细胞内叶绿体会产生大量的ROS。在这项研究中，四环素处理过的植物的叶绿素含量比对照低得多。此外，四环素还促进了根中ROS的产生，这表明ROS可能是通过叶绿体以外的途径产生的。根据以前的报道，在环境胁迫下，ROS的水平可以通过线粒体-ROS途径增加。脯氨酸依赖的ROS可以通过线粒体途径由脯氨酸氧化酶产生。据报道，四环素还可以通过NOX4 mRNA的急剧增加来促进ROS的产生。
作者还研究了暴露于四环素后细胞通透性的变化，如图4f所示。除了在10 mg/L四环素下的高浓度暴露外，在芽中，对照和四环素处理之间的细胞通透性没有显著差异。10 mg/L四环素的荧光强度比对照高99.85％。在根部，10和100 mg/L四环素处理的荧光强度分别比对照高99.67％和99.60％。荧光强度的上调类似于响应四环素的ROS水平的变化。对小球藻和斜生栅藻的研究表明，低浓度的四环素可增加细胞的通透性，高浓度的四环素可降低细胞的通透性。我们的研究获得了不同的结果。 这种差异可能与细胞质膜蛋白质组成的差异有关。通过JC-1染色评估线粒体膜电位损失（图4g）。结果显示在图4g中，与对照相比，在用100 mg/L四环素处理的植株中，芽和根部的荧光强度比率（红色:绿色）分别降低了16.00％和26.73％。这些结果表明，高浓度的四环素可能通过激活线粒体-ROS途径触发了强烈的氧化应激。
图4 用四环素处理的黑麦草中的氧化应激。a–d，通过荧光显微镜对芽中的活性氧（ROS）进行分析；a，对照；b，以1 mg/L的四环素处理的植株；c，用10 mg/L四环素处理的植物；d，以100 mg/ L四环素处理的植物；e，ROS的相对水平；f，细胞通透性的变化；g，线粒体膜电位损失。不同的字母表示在P <0.05时有显著差异。
3 抗氧化酶活性和MDA含量
作者进一步检测了四环素对抗氧化酶的影响，例如过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）。根据以前的报道，ROS可能会破坏植物细胞的正常代谢活性，并可能对生物大分子和小的生物分子造成氧化损伤。抗氧化防御系统可以抵消ROS的有害作用。抗氧化酶活性的变化可以揭示ROS的消散情况。四环素对抗氧化酶和MDA含量的影响如图5所示。
图5 四环素对a，超氧化物歧化酶（SOD）活性；b，过氧化物酶（POD）活性；c，过氧化氢酶（CAT）活性和d，丙二醛（MDA）含量的影响。不同的字母表示在P <0.05时有显著差异。
SOD对于维持植物细胞中的氧化还原平衡很重要。在四环素处理下SOD活性的变化如图5a所示。随着四环素浓度的增加，芽中的SOD活性增加，但对照和四环素处理无明显差异。与对照组相比，1、10和100 mg/L四环素处理分别显示出24.68％，28.63％和56.20％较高的SOD活性。对于植物而言，SOD是抗氧化防御系统的关键组成部分。它清除超氧阴离子并将其转化为H2O2和O2。氧化胁迫可以显著增加SOD的活性。经四环素处理的植株已显示出积累的O2ˉ，其通过SOD活性增加而被解毒。
POD活性仅在对照和100 mg/L四环素处理之间有所不同。与对照组相比，10和100 mg/L四环素处理分别显示出高7.04％和66.76％的POD活性（图5b）。这表明高四环素浓度会引起氧化应激。先前的研究表明，POD会影响病原体和创伤，从而影响木质素和乙烯的合成以及吲哚-3-乙酸的分解。在最近的一项研究中，四环素（0-8微克/千克）降低了豌豆的POD活性。这些结果与我们的结果之间的差异可能与植物种类，生长期和/或环境因素的差异有关。
四环素组中CAT的活性比对照中的低得多。与对照组相比，1、10和100 mg/L四环素处理的CAT活性分别降低了43.28％，38.63％和63.01％。1和10 mg/L四环素组的CAT活性分别比100 mg/L四环素组高53.33％和65.91％（图5c）。在植物中，CAT是消除ROS的最重要酶之一，它与抗氧化防御系统的其他成分协同作用，以减少H2O2的破坏作用。它可以将H2O2转化为H2O和O2，从而减少对H2O2的破坏量。根据以前的报道，在胁迫下，SOD活性增加而CAT活性降低。我们的发现与这些一致。而其他研究报告报道胁迫会导致SOD活性降低，而CAT活性升高。这些矛盾的结果表明，抗氧化防御系统不稳定，并且会随时间变化。在环境胁迫下，植物会不断调节抗氧化酶的活性以严格控制ROS水平。高胁迫水平会抑制抗氧化酶的活性，并对植物的生长和发育产生负面影响。
与对照组相比，在1、10和100 mg/L四环素处理中，MDA含量分别增加了0.73％，176.11％和160.66％（图5d）。胁迫会导致脂质过氧化物MDA含量增加。MDA含量是细胞损伤的指标，因为MDA是多不饱和脂肪酸的分解产物。在10和100 mg/L四环素处理中，MDA含量显著增加，表明存在广泛的氧化损伤。
4 代谢分析
进行了衍生化的气相色谱-质谱（GC-MS）以检测代谢产物。如图6a的热图所示，在根部鉴定出69种代谢物。与其他研究中已用于代谢分析的1H NMR技术相比，通过GC-MS分析进行样品衍生化是分析代谢产物的有效方法。鉴定出的代谢产物包括有机酸，氨基酸，碳水化合物，三羧酸和小分子。层次聚类（HCL）分析将处理分为两组：100 mg/L四环素处理和对照/1/10 mg/L四环素处理。后者分为两个亚组：10 mg/L四环素处理和对照/1 mg/L四环素处理。这些结果证明四环素诱导代谢改变。
在PCA分析中，根系中的代谢物在各种处理方法之间分布良好。为了验证根长与根中代谢物变化之间的关系，应用OPLS-DA分析，将根长作为Y变量，将代谢物作为X变量。结果表明，不同处理对代谢的影响不同。如图6a-b所示，45种代谢物表现出正系数，表明这些代谢物对根的延伸具有正功能。残留的24种代谢产物具有负功能。葡萄糖，莽草酸，乌头酸，丝氨酸，乳糖，苯丙氨酸，甘露醇，半乳糖，葡萄糖酸，天冬酰胺和吡喃葡萄糖的含量与根长呈正相关。这些代谢物的可变重要性投影（VIP）大于1.35，表明这些代谢物对根的延伸具有至关重要的功能（图6b）。
通过ANOVA分析代谢数据表明，四环素处理组和对照组之间的代谢物组不同，如图6c所示。对照组和四环素处理组之间的总代谢物，有机酸代谢物，胺酸代谢物和碳水化合物代谢物分别无显著差异。如图6d所示，通过MetaboAnalyst对四环素处理组和对照组的代谢途径进行了比较分析。对照组和四环素处理组之间的氨酰-tRNA生物合成（0.09302；5.591），氮代谢（0；3.589）和丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢（0.17808；3.0791）均分别显示出显著差异（P = 0.0037、0.0276和0.0460）。这些结果表明四环素可能通过调节这些代谢途径来影响根的延伸。氨酰-tRNA是蛋白质合成机制的组成部分，由氨酰-tRNA合成酶产生，并通过延伸因子转运至核糖体。氨酰-tRNA合成酶可以通过在翻译过程中将同源tRNA与它们的同源氨基酸精确配对来清除遗传密码。氮代谢与光合作用的碳同化有关，在植物生长发育中起着重要作用。
作者还分析了四环素对一些主要代谢产物丰度的影响（图7）。四环素显著提高了乙醇胺，甘露糖，鸟氨酸和缬氨酸的水平。研究表明，甘露糖和活性氧具有相似的作用，并且可以触发气孔关闭。鸟氨酸可以调节相关氨基酸和多胺的组成，这些氨基酸和多胺被认为是至关重要的信号分子。缬氨酸是一种支链氨基酸，可立即和间接地参与许多关键的代谢功能，包括氨酰-tRNA的生物合成。
同时，4-羟基丁酸，5-氧脯氨酸，腺嘌呤，天冬酰胺，纤维二糖，柠檬酸，果糖，半乳糖，葡萄糖酸，吡喃葡萄糖，葡萄糖，谷氨酸，谷氨酰胺，乳糖，苹果酸，麦芽糖，甘露醇，苯丙氨酸，丝氨酸，莽草酸，蔗糖，酒石酸，木糖醇和木糖的水平在四环素存在下显著降低。丝氨酸是叶绿素合成的前体，参与嘌呤和嘧啶的生物合成。在这项研究中，四环素暴露后丝氨酸水平显著降低，这反映了叶绿素水平的显著降低（图2）。在另一项研究中，丝氨酸的下调与代谢水平上ROS含量的变化有关，类似于我们的研究。谷氨酰胺酶可以将谷氨酰胺（非必需氨基酸）转化为谷氨酸，而谷氨酸脱氢酶可以将谷氨酸转化为α-酮戊二酸。这些反应的产物用于后续的酶促反应中，以维持线粒体呼吸和三磷酸腺苷的生成。谷氨酸是一种非酶性抗氧化剂，可以调节细胞内抗氧化剂的形式，参与谷胱甘肽的组成。某些氨基酸（5-氧脯氨酸，天冬酰胺和丝氨酸）含量的降低与氧化应激的增加有关。苯丙氨酸可作为莽草酸途径中大规模次级代谢产物的底物。葡萄糖酸被认为是植物中细胞内葡萄糖的分解和消耗的参考。但是，葡萄糖的分解代谢（6-磷酸葡萄糖和吡喃葡萄糖）为植物生长提供了能量，并减轻了氧化应激，而6-磷酸葡萄糖可以生成半乳糖。因此，在四环素胁迫下，葡萄糖，吡喃葡萄糖，半乳糖和葡萄糖酸含量的降低可能抑制了根的延伸。在代谢分析中，葡萄糖，半乳糖，葡萄糖酸和吡喃葡萄糖具有较高的VIP值，表明它们可能在根部延伸中起关键作用。四环素可能调节这些化合物的积累，从而影响根的延伸。为了进一步研究四环素对黑麦草根系的作用机理，我们计划对代谢产物和基因转录本进行综合分析。通过qPCR技术验证发芽过程中四环素胁迫下特定基因的表达水平。
图6 根的代谢分析。a，显示代谢物相对含量的代谢物热图，并采用层次聚类（HCL）模型进行聚类分析；b，OPLS-DA的代谢物系数为X变量，根长为Y变量，星号表示VIP（可变重要性投影）大于1.35的代谢物；c，在对照和四环素处理之间，代谢物的丰度差异显著；d，对代谢物代谢途径的分析显示，对照和四环素处理之间的丰度差异显著。
图7 代谢图。蓝色和红色分别代表与对照相比四环素处理中代谢物含量的上调和下调。
结论
这项研究表明四环素可以影响黑麦草的生长和代谢。四环素抑制生长和生物量积累，减少色素含量，增加ROS水平，SOD活性和MDA含量，并降低CAT活性。代谢分析为黑麦草对四环素的应激反应提供了新的见解。我们分析了代谢物与根长之间的关系，并确定了在四环素处理下显示出丰度变化的代谢物。对照和经四环素处理的植物之间的总代谢物，有机酸代谢物，胺酸代谢物和碳水化合物代谢物没有显著差异。根长与45种代谢产物呈正相关，与24种代谢产物呈负相关。葡萄糖，莽草酸，乌头酸，丝氨酸，乳糖，苯丙氨酸，甘露醇，半乳糖，葡萄糖酸，天冬酰胺和吡喃葡萄糖的含量与根长呈正相关，且具有重要的可变重要性投影值，在四环素处理下其丰度降低。在根部，四环素会影响氨酰-tRNA的生物合成，氮代谢以及丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的代谢。这些结果表明四环素抑制黑麦草的生长和发育并影响其代谢。此外，需要采用进一步研究以探索四环素响应代谢物对黑麦草生长和发育的影响。
评论
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2019.120885