科研| J Cell Mol Med：异甘草酸镁通过调节能量稳态预防非酒精性肝脂肪变性（国人佳作）
编译：张娜，编辑：Emma、江舜尧。
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实验设计
在本研究中，首次研究了MGIG对HFD小鼠肝脏脂肪变性的影响。目的：探讨MGIG的药理作用，并探讨其作用机制。
C57小鼠随机分为5组：对照组、HFD组、阿托伐他汀组(HFD+阿托伐他汀20 mg/kg，腹腔注射)、MGIG 10 mg/kg组(HFD+MGIG 10 mg/kg，腹腔注射)和MGIG 30 mg/kg组(HFD+MGIG 30 mg/kg，腹腔注射)。用经典食谱(Hayek饮食)配制的HFD模式连续喂食12周。对照动物在此期间给予标准饮食。从第7周开始，MGIG小鼠腹腔注射MGIG(10 mg/kg或30 mg/kg)，1次/d，连续6周；阿托伐他汀组给予阿托伐他汀20 mg/kg/d灌胃1次。在此期间，对照组和HFD组小鼠生理盐水处理。实验结束后处死小鼠，腹主动脉采血。血清4°C 7000g离心10min，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。取肝脏，称重，检测肝脏总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）水平；定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测mRNA水平；Western blotting检测蛋白水平；液相色谱-四极杆/飞行时间质谱(LC-Q/TOF-MS)进行代谢组学分析及转录组测序。部分肝脏固定后进行苏木精伊红(H&E)染色、油红O染色、透射电镜。采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。
实验结果
1. MGIG对肝脏脂肪变性的影响
首先，作者研究了MGIG对HFD小鼠肝损伤的保护作用。如图1所示，HFD会导致体重、转移酶活性和血脂异常。阿托伐他汀和MGIG(30 mg/kg)能有效地抑制HFD所致的缺氧和肝水肿，表现为体重下降和肝指数(肝重/体重比)的改善。阿托伐他汀和MGIG组中，ALT、AST活性升高被逆转。MGIG干预可明显改善血脂异常，表现为TG、TC和LDL-C水平明显降低，但对HDL-C的水平无明显影响。组织病理学分析表明，与HFD鼠相比，MGIG鼠的肝脏空泡较少，炎症浸润减少(图2A)。
接着，作者评估了肝脏脂肪变性的严重程度。如图1E所示，MGIG治疗可显著减弱HFD引起的肝脏TG水平的升高，但对TC水平无明显影响，提示MGIG可改善HFD诱导的TG沉积，但不能减轻胆固醇应激。油红O染色显示，MGIG对脂质堆积有明显的抑制作用，这与肝脏TG含量的变化趋势一致(图2B)。对肝脏样本进行透射电镜观察超微结构发现，MGIG组肝脏胞浆内脂滴数量与对照组无差异，但HFD组有大量脂滴形成(图2C)。因此，MGIG对HFD诱导的肝脏脂质过氧化有一定的改善作用。
图2. MGIG对HFD诱导的肝脏脂质蓄堆积的影响
(A)组织病理学的改变。(B)油红O染色。(C)透射电镜显示肝脏线粒体和脂滴的超微结构。所有数据均以平均数±SDS表示。#P＜0.05，##P＜0.01，#P＜0.001。与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(n=3)。
2. MGIG通过调节三羧酸循环中谷氨酸的吸收来改善能量代谢
如图2C所示，对照组内质网超微结构清晰可辨，细胞线粒体丰富，嵴结构完整。HFD组则有不同程度的超微结构异常，表现为大量的脂肪空泡和细胞质中的线粒体明显膨胀，嵴结构破坏。与HFD组相比，MGIG治疗减轻了HFD诱导的异常改变，特别是在线粒体完整性方面。这些数据表明，MGIG通过减少线粒体损伤来减轻HFD引起的脂毒性。
鉴于MGIG样本中线粒体结构的改善，作者进行代谢组学分析，以评估MGIG是否通过影响代谢模式而影响线粒体形态的改变。在HFD组观察到代谢异常，MGIG处理后肝脏整体代谢组学明显逆转。主成分分析和热图显示了不同组之间的不同特征，反映了HFD组和MGIG干预后显著的代谢变化(图3A-C)。在MGIG(30 mg/kg)组肝脏发生改变的代谢物中，谷氨酸-Tamate和TCA循环相关的代谢物发生了显著变化(图3D)。与HFD组相比，MGIG组肝脏谷氨酸水平较高，而谷氨酸前体谷氨酰胺的水平较低，提示MGIG可促进谷氨酰胺向谷氨酸的转化。这些数据表明，MGIG处理增加谷氨酸水平从谷胱甘肽合成转移到TCA循环，导致肝脏能量代谢增强和谷胱甘肽水平降低。
图3. MGIG通过调节谷氨酸进入TCA循环，改善能量代谢
(A) 代谢组学分析。对照组、HFD模型组和MGIG组肝脏数据的PLS-DA图。(B)对照组、HFD模型组和MGIG组肝脏数据的SPLS-DA 3D图。(C) MGIG鼠和HFD鼠肝脏代谢物热图。(D)MGIG处理后肝组织中与谷氨酸和TCA循环代谢途径相关的代谢物。所有数据均以平均数±SDS表示。#P＜0.05，## P＜0.01，# P＜0.001。与模型组比较：* P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001 (对照组：n=8，HFD：n=6；MGIG：n=8)。
3. MGIG对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的影响
为了进一步探讨MGIG在线粒体氧化还原反应中的影响，作者对线粒体标志物NAD+进行了检测，NAD+是线粒体呼吸链中一种重要的代谢物和常见的氢载体。由于NAD+向NADH的转化在线粒体脂肪酸和氨基酸的氧化过程中起着关键作用，因此NAD+/NADH的比值被普遍用于线粒体活性的诊断。结果表明，与HFD模型组相比，MGIG治疗组肝脏中NAD+和NADH的水平降低，MGIG治疗组和阿托伐他汀组NAD+/NADH比值明显升高(图4A)。这些数据表明，MGIG和阿托伐他汀均可促进脂质代谢。NAD+/NADH比率的改变直接影响脱乙酰酶sirtuin 1(Sirt1)，该酶协调从葡萄糖到脂肪酸代谢的代谢转换。如图4B所示，MGIG组和阿托伐他汀组逆转了HFD诱导的Sirt1水平的下降。
图4. MGIG通过促进脂质代谢改善肝脏脂肪变性
(A)肝脏NAD+、NADH水平及NAD+/NADH比值。(B)肝组织中去乙酰化酶sirtuin1(Sirt1)的蛋白表达及其定量数据。(C)脂质合成相关基因表达。(D)脂代谢相关基因表达量。所有数据均以平均数±SDS表示。#P＜0.05，## P＜0.01，# P＜0.001。与模型组比较：* P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001 (n=6)。
4. MGIG对肝脏脂质代谢相关基因表达的影响
为探讨MGIG治疗肝脏脂肪变性的机制，作者采用定量PCR方法分析了脂质代谢相关基因的表达。如图4C所示，HFD刺激显著上调了参与脂化的基因，如硬脂酰辅酶A脱饱和酶-1(SCD1)和分化簇(CD36或脂肪酸转移酶(FAT))的表达。与HFD组相比，MGIG组脂质合成基因如SREBP1c、SCD1和CD36 mRNA水平显著降低，肝X受体α(LXRα)、AMPK、PPARα和PGC1 mRNA水平升高(图4 D)。
5. MGIG的抗炎作用
接下来，作者进行了转录组图谱分析，以进一步探讨MGIG对HFD所致肝脂肪变性的保护作用的机制。如图5A所示，MGIG处理逆转了HFD诱导的基因表达的变化。MGIG组和HFD组差异基因的聚类分析显示，TLR4结合通路的基因变化最显著(图5B)，提示HFD条件下，与MGIG可激活先天免疫TLR4通路。
接下来，作者采用qPCR技术研究天然免疫系统TLR亚型TLR2、TLR4和TLR9在肝脏中的表达。结果显示，HFD组TLR4 mRNA表达显著上调，MGIG干预则会使TLR4 mRNA 水平下调(图5C)。且TLR4相关基因HMGB1、MyD88、Nlrp3、Asc和caspase-1的表达趋势相同，表明TLR4信号参与调节HFD的能量代谢稳态。
随后，作者重点研究了MGIG干预对HFD诱导的肝脂肪变性中TLR4/NF-κB/Nlrp3信号通路蛋白水平的影响。如图6A所示，HFD组肝组织中TLR4蛋白水平升高，NF-κBp65磷酸化和Nlrp3炎性小体活性增加。给予阿托伐他汀和MGIG可有效逆转上述变化。这些结果提示，MGIG可能通过抑制TLR4/NF-κB/Nlrp3途径介导的炎症反应，对能量代谢稳态起到保护作用。然后，作者通过测定炎症细胞因子水平来评价MGIG的抗炎作用。如图6B所示，MGIG (30 mg/kg)可显著抑制血清中TNF-α和IL-1β的分泌。提示MGIG可通过调节NAFLD高脂血症小鼠的TLR4信号转导来抑制炎症反应。
图5. MGIG抑制TLR4通路与其保护作用有关
(A) 转录组图谱分析显示MGIG治疗逆转的热图。左栏代表MGI组G与HFD组的差异基因，右栏代表HFD组与对照组的差异基因。(B)将MGIG组和HFD组的显著差异基因进行聚类分析。(C)PCR检测TLR亚型的基因表达。(D)PCR检测TLR4相关基因的表达。所有数据均以平均数±SDS表示。#P＜0.05，## P＜0.01，# P＜0.001。与模型组比较：* P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001 (n=6)。
图6. MGIG的抗炎特性是其抗脂化的重要原因
(A)MGIG对肝脏HMGB1、TLR4、MYD88蛋白表达、NF-κBp65磷酸化及Nlrp3炎症小体活化的影响。(B)血清TNF-α、IL-1β水平。数据以平均数±SDS表示。所有数据均以平均数±SDS表示。#P＜0.05，## P＜0.01，# P＜0.001。与模型组比较：* P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001 (n=6)。
讨论
肝脏脂肪变性归因于脂质输入(脂质摄取和脂肪生成)和输出(脂质输出和氧化)之间的失衡。肝细胞内游离脂肪酸水平的增加导致β氧化受阻，进一步加剧脂质堆积。研究表明，NF-κB调控的炎性细胞因子参与了NAFLD的发生发展。研究报道NAFLD患者和HFD小鼠中NF-κB的高表达。5'-腺苷单磷酸（AMP）活化的蛋白激酶（AMPK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它能维持能量平衡，并驱动过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和PPAR-γ共活化1α的下游活化。AMPK介导的能量代谢可促进HFD喂养鼠的脂肪酸氧化。
乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）和FASN在调节肝脏脂肪酸合成中发挥重要作用。然而，ACC1和FASN的表达受SREBP-1c的调控。在NAFLD患者和HFD患者中，观察到肝脏SREBP-1c及其靶脂质合成酶FASN和ACC1的水平显著升高。本研究发现，MGIG可用于纠正代谢紊乱，这可能与抑制SREBP-1c及其下游靶分子SCD1和FAT(CD36)的表达有关。
此外，MGIG治疗后脂代谢也发生了明显的变化。AMPK是一种敏感的能量代谢调节器，刺激葡萄糖和脂质产生能量，同时抑制能量消耗。最近的研究表明，在HFD诱导的肝脂肪变性小鼠中，AMPK的表达减少，表明AMPK在NAFLD的发病机制中发挥作用。作为AMPK的关键下游靶点，PGC-1α直接被磷酸化的AMPK激活，作为线粒体和氧化代谢的转录调节器。随后，PGC-1α去乙酰化激活PPARα复合物，从而调控代谢相关基因的转录。最近的研究发现，PPAR-α基因敲除鼠肝脏FFA氧化严重紊乱，影响肝脏的加工，导致肝脏脂质堆积和血脂异常。本研究发现，依赖NAD+的Sirt1可能与上调AMPK/PGC-1α/PPARα基因，促进脂质氧化有关。
NF-κB是一种与炎症相关的介质，是脂肪性肝炎的主要介质。研究发现，HFD可以诱导肝细胞NF-κB的激活以及肝脏胰岛素抵抗。研究还表明，肝实质细胞中TLR4信号的激活，伴随NF-κBp65移位到细胞核中，参与了NAFLD的发病。此外，肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)家族成员相关的NF-κB激活物(TABK1)是TLR4信号的下游效应因子，在介导能量感知和炎症信号通路之间的双向串扰中发挥着重要的作用。虽然许多研究已经提出Sirt1和TLR4之间存在负相关，但具体机制未明。
结论
本研究发现MGIG可通过促进谷氨酸向α-酮戊二酸的转化来改善能量代谢。然而，关于TLR4对能量代谢的影响的信息很少，值得进一步研究。综上所述，本研究表明，MGIG通过抑制脂质过氧化，改善组织病理学和线粒体的活性，来减轻HFD鼠的肝脏脂肪变性。并且，TLR4可能是调节肝脂肪变性能量平衡的重要靶点。