编译：朱雯君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
目的:肝-微生物轴作为自身免疫的主要调节因子，其重要意义日益受到重视。本研究的目的是利用大量明确定义的皮质激素治疗的自身免疫性肝炎(AIH)患者，与健康对照组相比严格描述肠道菌群失调。本研究通过16S rRNA基因测序对AIH患者(n=91)和健康对照组(n=98)进行了横断面研究。分析了28例患者和34例对照组的独立队列以验证结果。所有患者均收集于糖皮质激素治疗前。
原名：Alterations of gut microbiome in autoimmune hepatitis
期刊：Gut
IF：11.878
发表时间：2019.07
通讯作者：马雄
作者单位：上海交通大学医学院仁济医院原癌基因及相关基因国家重点实验室卫生部消化与肝脏病学重点实验室;上海消化疾病研究所
1 研究设计和样本收集
本研究共纳入119例AIH患者，均为糖皮质激素幼稚型。69例患者在入组前至少2周一直服用熊去氧胆酸(UDCA)。48例患者在入组前1个月内进行了肝活检，因此暴露于抗生素下1天。挑选了132名健康对照者，以匹配AIH患者的年龄、性别和体重指数(BMI)。对照组入选标准:首先，我们进行了一项横断面研究，研究对象为91名患有AIH的类固醇初治患者，和98名年龄、性别及BMI与健康对照组相匹配的志愿者。随后，由28名类固醇类患者和34名对照组组成的独立队列对结果进行了验证。发现组和验证组的划分是在数据分析之前进行的。
2 肝脏组织学评估
来自两个队列119例AIH患者中有90例接受了肝脏活检。所有活检均由两名经验丰富且“盲法”的肝病理学家进行评估。典型的AIH诊断特征包括交界性肝炎、门管区淋巴细胞/淋巴浆细胞性浸润、坏死和肝莲座形成。根据Scheuer系统评估炎症和纤维化的严重程度:炎症分级0-4级，纤维化分级0-4级。
3 DNA提取和16S rRNA基因测序
如前所述进行了16s rRNA测序。简单地说，使用试剂盒提取细菌基因组DNA。通过PCR扩增16S rRNA V3-V4区，利用MiSeq平台进行测序(Illumina, San Diego, California,USA)
4 16S rRNA测序的生物信息学分析
利用微生物生态学定量分析16S rRNA测序数据(QIIME2 V.2018.2)使用封装在QIIME2中的20 DADA2软件对测序读进行过滤，构建特征表。然后，我们使用vsearch插件将序列以97%的身份聚类成操作分类单元(OTUs)，并根据Greengenes数据库分配分类法(V.13.8)。为了使伪序列的影响最小化，我们删除了OTUs，删除的序列数小于总序列数的0.005%。过滤后，每个样本平均得到32 708个读数(最小值:20178;最大值:42 988)。然后使用MAFFT对序列进行比对，使用FastTree插件生成系统发育树。多样性分析采用Q2-多样性进行，取样深度为20178。肠道微生物组的功能由16S rRNA序列与PICRUSt进行推测。
5 数据分析
应用线性判别分析效应量(LEfSe)分析来识别病例和对照之间差异丰富的分类单元或通路。该方法首先利用非参数因子Kruskal-Wallis和秩检验来检测具有显著差异丰度的特征，然后利用线性判别分析(LDA)来计算每个特征的效应大小。利用多变量关联线性模型算法(MaAsLin)对协变量与具有默认参数的微生物类群或途径的丰度进行关联检验，以消除影响。用R进行统计分析(V.2.15.3)。回归检验(glm函数)前对相对分类单元丰度进行arcsin平方根变换。我们采用多变量逐步逻辑回归分析，以确定最好的区分使用插入符号包AIH与控制的属。输入特征由11个AIH相关的属组成，然后用glmStepAIC方法进行特征消除，选择最优特征并优化模型。构建操作特征曲线(接收操作曲线，ROC)，计算曲线下面积(AUC)，利用pROC包评估模型的诊断性能。其他统计分析包括Fisher’s exact test, Kruskal-Wallis test 和partialSpearman’s rank correlation (PResiduals package)
1 首次治疗类固醇AIH
本文研究了一大群具有良好特征的粪便微生物群，其中包括119名新诊断的AIH患者，以及132名年龄、性别和BMI匹配的健康对照组。所有入组患者在标准类固醇治疗前均提供粪便样本。119例患者中有90例接受了肝脏活检并进行了肝脏病变表型分析。根据受试者登记顺序，整个队列被分成一个发现小组(AIH: 91;控制:98)和验证面板(AIH:28;控制:34)。表1详细列出了该队列的人口学、临床和肝脏组织学特征。
表1* AIH与对照组的比较。†探索队列和验证队列中AIH的比较。
AIH、自身免疫性肝炎;AKP,碱性磷酸酶;ALB,血清白蛋白;ALT,丙氨酸转氨酶;AST、天冬氨酸转氨酶;ANA,抗核抗体;ASMA抗平滑肌抗体;BMI，身体质量指数; F-actin,肌动蛋白;GGT, 谷氨酰转氨酶;SLA/LP可溶性肝抗原/肝胰腺抗原; TB，总胆红素;UDCA,熊去氧胆酸。
2 细菌多样性降低，整体微生物组成发生改变
在discovery队列中，通过Shannon多样性指数和观察到的OTUs数量(分别为p=0.0041和p=0.0018,Wilcoxon秩和检验;图1 a)。经年龄、性别和BMI (p=0.023和p=0.0070)调整后，结果得到证实。排除服用抗生素的患者后，与健康对照组相比，AIH肠道菌群的多样性仍然明显减少。虽然在未接受UDCA治疗的患者中也观察到这一趋势，但只有观察到的OTUs数量达到统计学意义(见网上补充图1)。为了评估微生物组成的总体多样性，我们进行了基于unweighted UniFrac distance的主坐标分析。Permutationalanalysis of variance显示AIH和健康对照组的肠道分类学组成有显著差异(伪pseudo-F: 3.31, p=0.002，图1B)。加权UniFrac距离(pseudo-F:2.72, p=0.018)和Bray-Curtis差异(pseudo-F:2.35, p=0.002，见网上补充图2)两组间微生物群落也存在显著差异。
图1 类固醇治疗初期AIH患者(n=91)与健康对照组(n=98)的α-多样性和β-多样性的比较。(A)与对照组相比，AIH中观察到的OTUs和Shannon多样性指数明显减少。(B)基于unweighted UniFrac matrix的PCoA显示，AIH与对照组的整体粪便菌群组成不同(伪f: 3.31, p=0.002)。方框表示分布的第25- 75个百分点;中位数在方框中间以粗线表示;晶须延伸到1.5倍的差异值。IH、自身免疫性肝炎;OTU，操作分类学单位;PCoA，主坐标分析。
3 与对照组相比，AIH中的细菌数量存在差异
为了鉴别差异丰富的类群，我们对91个患有AIH的类固醇初治患者和98个健康对照进行了粪便微生物区系组成的LEfSe分析。拟杆菌门和厚壁菌门是AIH和健康对照组中最主要的门。然而，两组之间在门水平上没有明显的变化(图2A)。在属水平上，AIH与对照组之间存在显著差异(见在线补充图3)。两组间有15个细菌类群相对丰度差异显著(LDA评分>2.0,p<0.05)。在对年龄、性别和BMI等协变量进行调整后，11个在AIH中发现梭菌属、RF39、瘤胃球菌科、Rikenellaceae、Oscillospira、对甲酰亚胺、Coprococcus等细菌丰度降低，Veillonella、Klebsiella、链球菌、Lactobacillus等细菌丰度升高。最值得注意的是，之前被认为与PBC和原发性硬化性胆管炎(PSC)相关的Veillonella属，与疾病状态的相关性最强(p=2.28E-6, LDA评分=4.15)。我们注意到，Veillonella属的关联可以归因于Veillonella dispar (p=8.85E-8，图2C)属仍存在显著差异(图2B)。为了进一步验证结果，我们进行了多变量分析(MaAsLin)来控制年龄、性别、BMI、抗生素使用和UDCA治疗的可能影响。我们确认了11个属中有7个属的AIH与对照组的丰度存在差异(p<0.05，见在线补充表1)。再次，Veillonella属与疾病状态的相关性最显著(p=0.0014)。
图2 AIH中粪便菌群组成的变化。(A) AIH中细菌门的相对比例(n=91)和对照组(n=98)。(B) LDA效应大小分析显示AIH与对照组11属相对丰度有显著差异。(C)Veillonella是差异最丰富的属，主要归属于Veillonella dispar。V. dispar的相对丰度以对数标度绘制，0的值赋值为1e-06。图1中提供了箱线图。†使用MaAsLin方法时，因年龄、性别、BMI、抗生素和UDCA的使用而改变，仍然与AIH相关。* p < 0.05, * *p < 0.001, * * * p <0.0001, * * * * p < 0.00001, * * * * * p < 0.000001。AIH、自身免疫性肝炎;BMI，身体质量指数;LDA线性判别分析;MaAsLin，多元关联与线性模型算法;UDCA,熊去氧胆酸
4 基于肠道微生物的特征识别疾病状态
接下来，我们评估了利用肠道微生物群作为生物标志物的潜在价值。首先，仅使用Veillonella属作为预测因子，在接收操作特征曲线(AUROC)下生成的面积为0.70 (95% CI 0.62 到0.77)。此外，多变量逐步逻辑回归分析应用于AIH相关属的列表，以确定最佳区分AIH与对照的分类单元。我们发现包括Veillonella、Lactobacillus、Oscillospira和Clostridiales在内的4个属的组合可以将AIH与AUC为0.78 (95% CI 0.71 ~ 0.84)的对照组区分开来(图3A和C)。然而，使用所有11个属并没有显著提高预测性能(AUC: 0.78, 95% CI 0.72至0.85)。使用MaAsLin确认的7个属，AUC为0.74 (95% CI 0.67 ~ 0.81)。该模型的分类能力随后在28个激素幼稚型AIH和34个对照组的独立队列中得到验证。为区分AIH和对照组单独的Veillonella菌属的AUC为0.69(95% CI，0.55~0.83)。使用上面描述的四个属AUC增加为0.81 (95% CI 0.70 - 0.92),类似于模型的性能来源于所有11 AIH-associated属(AUC: 0.78, 95%可信区间0.67到0.90)以及模型组成的七属验证MaAsLin (AUC: 0.81, 95%可信区间0.70到0.92)(图3 b)。因此，联合使用Veillonella、Lactobacillus、Oscillospira和Clostridiales对AIH患者具有潜在的高诊断价值。
图3 基于肠道微生物群特征的疾病分类。利用AIH相关属的相对丰度对多变量逻辑回归模型的分类性能进行了评估(A)探索数据(AIH: 91，对照:98)和(B)验证数据(AIH: 28，对照:34)的ROC面积。(C)可将AIH与对照品区分开的4个AIH相关属的相对丰度以对数标度绘制，0的值赋值为1e-06。AIH、自身免疫性肝炎;ROC，接收操作曲线。
5. 肠道微生物与AIH疾病活动的相关性
采用部分Spearman秩相关检验(Partial Spearman ranbasedcorrelation test)，考虑年龄、性别、BMI、抗生素和UDCA使用情况，调查所有激素幼稚型AIH的临床变量与疾病相关属的相关性(图4A)。我们只发现了Veillonella属的丰度与天冬氨酸转氨酶(AST)呈正相关(rho=0.216, p=0.022)。我们进一步研究了V. dispar，发现该物种与AST的相关性更显著(rho=0.266, p=0.005)。AIH样本然后根据dispar中位数水平二分诉，AIH患者dispar丰度高(n = 60)有大约增加两倍的血清AST水平与较低的物种的丰富性(n = 59) (p = 0.010, Wilcoxon rank-sum测试,图4 B)。在AIH患者中，肝脏组织学在诊断和评估疾病严重程度方面起着关键作用。在本研究中，我们收集了90例AIH患者的肝脏组织学数据，从而探索肠道微生物群与AIH组织病理学程度之间的关系。轻度/中度(0-2级)炎症27例，重度(3-4级)炎症63例; 而36例轻度或中度(0 - 2阶段)纤维化,54例有严重(3 - 4阶段)纤维化(见在线补充表2)。因此,α-diversity或β-diversity没有明显炎症相关等级或纤维化阶段患者(见在线补充图4和 图5)。此外，我们没有发现任何与AIH相关的属与晚期纤维化相关。有趣的是，只有轻度/中度炎症和重度炎症患者的Veillonella丰度存在显著差异(p=0.044, Wilcoxon秩和检验，图4C)。具体来说，V. dispar在晚期炎症病例中更为丰富(p=0.013, Wilcoxon秩和检验，图4C)，强调其作为非侵入性生物标志物补充肝脏活检的潜力。然而，这些发现并没有经受住线性回归分析的控制。
图4 肠道微生物群与AIH疾病活动的关系。(A) heatmap显示AIH 11属与临床指标的部分Spearman相关系数。(B)与低丰度组(n=59)相比，高丰度组(n=60)血清AST水平更高。(C)晚期炎症患者(63例)中Veillonella和V. dispar明显高于轻度/中度炎症患者(27例)。* P < 0.05。AIH、自身免疫性肝炎;AKP,碱性磷酸酶;;ALT,丙氨酸转氨酶;AST、天冬氨酸转氨酶; F-actin,肌动蛋白;GGT, 谷氨酰转氨酶;SLA/LP可溶性肝抗原/肝胰腺抗原; TB，总胆红素;UDCA,熊去氧胆酸。
6. AIH中微生物功能失调
为了研究AIH和对照组之间微生物群落的功能和代谢变化，我们接下来从16S rRNA数据中推断出宏基因组，并使用PICRUSt分析肠道微生物群的功能潜力。LEfSe分析发现32个KEGG类，所有激素幼稚型AIH(n=119)与对照组(n=132)之间存在显著差异(LDA评分>2.0,p<0.05)。与MaAsLin混杂物对照后，17个功能模块仍与疾病状态显著相关(p<0.05，图5)。值得注意的是,我们发现脂多糖(LPS)生物合成诱导促炎细胞因子在AIH微生物组中过表达,这可能与AIH中更高的血清白细胞介素6和 TNF-α水平有关。此外, 与多种氨基酸代谢相关的功能模块被改变。例如，AIH的微生物组中涉及色氨酸代谢和赖氨酸降解的途径增加，而精氨酸的途径增加脯氨酸代谢水平下降。AIH菌群中谷胱甘肽代谢也高度富集。此外，包括细菌趋化作用在内的细胞运动在AIH菌群中显著降低。
图5 预测宏基因组的功能分析。LEfSe发现AIH (n=119)和对照组(n=132)中差异丰富的KEGG通路。利用马斯林校正协变量验证了17条通路。LDA评分(x轴)和p值在对数刻度上(y轴)被绘制出来。圆的大小表示每个模块的相对丰度。添加AIH的模块用红色表示，添加对照的模块用蓝色表示。AIH、自身免疫性肝炎;线性判别分析;线性判别分析效果大小;MaAsLin，多元联想智慧
类固醇治疗初治AIH的肠道菌群具有较低的alpha多样性(Shannon和观察到的操作分类学单位，均p<0.01)，与健康对照组相比，整体微生物组成明显不同(p=0.002)。专性厌氧菌的消耗和包括细孔菌在内的潜在病源的扩大与疾病状态相关。值得注意的是，与疾病相关性最强的类群(p= 8.85e-8)，即Veillonella dispar与血清天冬氨酸转氨酶水平和肝脏炎症呈正相关。此外，合并AIH相关属的4例患者，在探索和验证队列中，与曲线下面积约为0.8的对照组相比，AIH具有明显的不同。此外，AIH肠道菌群中多个预测功能模块发生改变，包括脂多糖的生物合成和氨基酸的代谢，这些氨基酸可被细菌处理产生免疫调节代谢物。该研究探究了AIH中肠道微生物组的组成和功能的改变，并提出了利用肠道微生物群作为非侵入性生物标志物来评估疾病活性的可能性。越来越多的证据表明，肠道菌群的改变与几乎所有已知的肝病或免疫性疾病相关。在此，我们通过16S rRNA基因测序的方法，在一个新近确诊的大的AIH队列中描绘了粪便微生物群落结构。我们的数据表明，AIH的特征是11个细菌属的细菌多样性较低，相对丰度改变。基于微生物特征，建立了具有疾病状态判别能力的模型。最值得注意的发现是，在AIH患者中高度富集的Veillonella属与疾病活动相关。与健康对照组相比，AIH患者粪便菌群的物种丰富度和均匀度下降。低细菌多样性在各种疾病中反复出现，认为是肠道菌群失调的主要类型之一。在我们之前的研究中，PBC与对照之间的样品内多样性差异不大，物种丰富，但PBC的均匀性并没有降低。AIH的肠道菌群失调以Veillonella、链球菌、克雷伯氏菌和乳酸菌的相对丰度升高和7种细菌的相对丰度降低为特征。有趣的是，在AIH中扩增的属在PBC和PSC中也有丰富的粪便菌群。值得注意的是，Veillonella与高水平的AST和晚期肝脏炎症相关。之前的研究表明，Veillonella产生了LPS，这与我们的发现一致，即LPS生物合成在AIH的肠道菌群中更加丰富。AIH患者的早期研究分析口腔微生物群,还发现增加的相对丰度在AIH韦永氏球菌属,水平呈正相关,IL-1β,引发唾液。据报道，Veillonella也参与了几种严重的炎症反应，包括复发性克罗恩病、骨髓炎和心内膜炎。除了相关证据外，小鼠模型还证明了肠道微生物在促进炎症或扰乱肠道内外免疫稳态方面的中心作用。综上所述，细孔菌可能促进了肝脏炎症的激活，尽管这种作用可能不是疾病特异性的。我们观察到AIH粪便中专性厌氧菌的减少和兼性厌氧菌的增加，包括链球菌、克雷伯氏菌和乳酸菌，这表明微生物群落向耐氧菌转移。许多厌氧肠道微生物，如瘤胃球菌科、粪球菌属和示波螺旋体属的物种，通过膳食纤维发酵产生短链脂肪酸(SCFA)。众所周知，SCFA通过抗炎对健康产生有益作用。微生物群减少SCFA的产生，使小鼠管腔内氧浓度升高。事实上，兼性厌氧菌替代厌氧菌可能是不同疾病条件下的常见表现，包括慢性肝病。组织学对于AIH的准确诊断是必要的，在疾病管理中也很重要。因此，发现用于评估AIH肝炎症和纤维化的非侵入性生物标志物的需求尚未得到满足。在本研究中，由Veillonella、Lactobacillus、Oscillospira和Clostridiales组成的模型能够准确区分AIH与健康对照组，并在独立队列中得到验证。我们的研究还发现，随着疾病从轻度炎症发展到重度炎症，V. dispar的丰度显著增加。这些结果为非侵入性粪便检查在AIH患者的诊断和分层中提供了潜在的帮助。除了明显增加的“LPS生物合成”途径外，推断的AIH宏基因组还以氨基酸生物合成和代谢相关模块的功能障碍为特征。例如，AIH的微生物组中色氨酸代谢被改变。色氨酸被肠道细菌降解为几种吲哚衍生物。吲哚作为芳基烃受体(AhR)的配体，通过分泌IL22促进上皮屏障功能。此外，AIH菌群中精氨酸代谢水平降低，导致多胺水平下降。作为免疫调节代谢物，多胺在肠粘膜和常驻免疫细胞的发育和维持中也起着重要的作用。值得注意的是，先前的研究表明AIH与肠道通透性异常和肠道菌群失调有关。本研究比较了24个AIH和8个健康对照组中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌的16S rDNA基因，发现AIH中双歧杆菌和乳酸杆菌的代表性不足。这项结果与他们的发现不一致这不奇怪，因为这里使用了一个更大的队列，包括没有使用类固醇治疗的患者。值得注意的是，最近的一项研究表明，在遗传易感的小鼠模型和包括AIH在内的自身免疫性患者中，Enterococcus gallinarum菌可移位至肝脏并触发自身免疫反应。在本研究中，我们发现粪便样本中Enterococcus gallinarum菌的相对丰度很低，且不显著AIH与控件之间的差异(参见在线补充图6)。我们的研究的主要优势包括在类固醇治疗开始前收集样本，使用一个大的队列，以及包括详细的表型活检证实的AIH。然而，需要注意几个限制。首先，利用16S rRNA基因测序而非宏基因组测序是这项研究的一个缺点，它限制了物种水平和功能分析方面的数据解释。其次，我们的发现可能会受到药物、饮食摄入和环境因素等混杂因素的影响。虽然在我们的分析中调整了抗生素和UDCA的使用，但药物的混杂效应可能没有得到彻底的评估。我们简单地将抗生素或UDCA暴露的协变量作为二分法处理，而不考虑剂量效应，这可能会扭曲它们对肠道微生物组成的影响。此外，其他药物如质子泵抑制剂在目前的研究中没有考虑。第三，这是一项单一的中心研究，可能会限制基于微生物的诊断模型的应用。最近，He等报道了宿主的区域差异对肠道菌群组成有很强的影响。需要包括来自世界不同地区的研究对象的多中心研究来概括这些发现。最后，本研究提供了关联而非因果关系的证据。进一步的研究是有必要的，以评估疾病相关的细菌，特别是V. dispar，是否和如何在AIH发病机制中发挥免疫功能障碍和肝脏炎症的作用。尽管如此，我们的数据报告了对新近诊断的大量AIH队列中肠道微生物群的全面调查，为疾病的发病机制提供了新的见解，并提高了在AIH分层中使用非侵入性生物标志物的可能性。
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