科研 | Microbiome：宏基因组学揭示了水生生态系统中以噬菌体为中心的生态相互作用
编译：流年梦，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在自然系统中，水生生态系统表现出时间和空间上的连续性，这种连续性对研究该生态系统成员之间的相互关系产生了困难。与此同时，在所有成员中，噬菌体是一类丰度最高的微生物，但是对噬菌体的种类和功能研究尚属空白。因此，该文基于超深度宏基因组测序技术，选择不同采样点、不同采样时间、不同采样位置的样本，研究了噬菌体在淡水系统中的物种分类和时空分布特征。
论文ID
原名：Phage-centricecological interactions in aquatic ecosystems revealed through ultradeep metagenomics
译名：宏基因组学揭示了水生生态系统中以噬菌体为中心的生态相互作用
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2019.10
通讯作者：Rohit Ghai
通讯作者单位：捷克共和国科学院中心
实验设计
结果
1. 宏基因组测序、组装和重组完整噬菌体基因组
本研究从23个样本中共采集到了1.9Tb的数据，其中大部分样本在54Gb左右。同时本研究还收集了来自其他研究的宏基因组样本，共计1.09Tb。所有样本都进行了单独组装。在组装数据中对病毒基因组进行筛选，选择长度大于10Kb的contigs，使用VirSorter和MARVEL鉴定是否是病毒。结果显示本研究的样本中获得1677个基因组，其他研究的样本中获得357个基因组，共计2034个基因组。该研究同时发现随着测序深度的增加，所获得的病毒基因组的数量并不是线性增加的（图1a）。
2. 噬菌体基因组分析
2034个噬菌体基因组分布在三个采样点中（Římov浅水层598个，深水层800个，Jiřická池塘279个），通过去冗余分析（95%相似度、95%覆盖度）发现三分之二的病毒基因组是重复的（图1b），在两个地点之间仅共有一个噬菌体。同时该研究收集了来自海洋生态系统（the Tara Oceansmetavirome assemblies（TOMA）and uvMED dataset）的噬菌体，并与淡水系统中的噬菌体进行了比较，其基因组大小分布结果如图1d和e所示，结果显示除了155个小基因组噬菌体外（约为15Kb），在两个系统中噬菌体基因组的大小分布相似，大部分分布在40-60Kb。比较GC%结果显示，淡水系统与海洋系统不相同，也侧面反映了菌群结构的不同（图1f）。以30%和60%分析蛋白的种类（图1g），淡水系统中病毒蛋白数量与海洋系统的病毒蛋白数量相似。同时比较了本研究发现病毒基因组与已知数据库中基因组的种类，结果发现淡水系统中发现了775个基因组是未在数据库中发现的，同时也发现553个海洋噬菌体独特基因组。结果证明存在与系统特征相关病毒。
图1 基因组统计。A测序深度与噬菌体基因组重组数量的关系；b不同样本中总噬菌体基因组数量和重复基因组数量的比较；c不同数据集样本中总噬菌体基因组数量和重复基因组数量的比较；d海洋噬菌体大小分布特征；e淡水噬菌体大小分布特征；f比较海洋噬菌体和淡水噬菌体GC%的差异；g在30%和60%相似度下，不同数据集独有蛋白的数量；h宿主预测噬菌体分布特征，插图代表更高物种分类水平下的分布特征；i GC%和长度的比较，不同颜色代表来自不同的数据集。
3. 宿主预测和噬菌体的生活方式分析
该研究通过宿主基因、tRNA相似性以及CRISPR位点对所有噬菌体的宿主进行预测，结果显示仅有20%的噬菌体匹配到宿主（404个），其中获得最多预测数的是采用whiB宿主基因进行的预测并且宿主为放线菌。这些放线菌噬菌体的基因组大小较为分散（图1h），说明水体中丰度最多的微生物被多种噬菌体感染。
虽然大部分放线菌噬菌体并不能很明确宿主，但是该研究发现部分可确认宿主的噬菌体，如属于acI进化分支的Ca.Nanopelagicales，acIV进化分支的Acidimicrobia和Luna进化分支的Microbacteraceae。
该研究也发现了其他微生物的噬菌体，如Betaproteobacterales, Alpha-and Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Cyanobacteria和Gemmatimonadetes。同时还发现6个噬藻体，以及在淡水系统中常见的微生物属如Limnohabitans, Polynucleobacter,Fonsibacter, Flavobacterium, Novosphingobium和Sphingomonas。
在24个淡水噬菌体中发现存在ADP核酸转移酶（一种真核毒素），该毒素可以抑制肌动蛋白的聚合，涉及吞噬被噬菌体感染的细胞以及定向裂解真核捕食者。254个淡水噬菌体中发现存在关于缓解氧气胁迫的基因，说明为了更好的生存，噬菌体为宿主提供了低于氧气胁迫的能力。同时根据文献报道大概50%的细菌会被单细胞真核生物所吞噬，同时具有较高的噬菌体感染率，因此该研究推测噬菌体存在两种生存策略（图2）：特洛伊木马策略和偶联噬菌体活性氧防御策略。
图2 淡水环境中的病毒生存策略。左侧代表特洛伊木马策略；右侧代表偶联噬菌体活性氧防御策略。
4. 不同时间点下的噬菌体丰度分布
该研究使用Římov水库样本研究了噬菌体在时间序列下的分布特征，从丰度频度上讲，不同时间点的样本中存在共有的噬菌体，例如其中一个噬菌体在所有12个时间点均被发现，说明噬菌体的存在具有持久型，这种持久性可能与宿主的持续存在有关，如Actinobacteria通常存在于是Římov水库中。但是噬菌体的丰度表现出季节性的波动性（图3）。
图3 来自Římov水库的1398个噬菌体的相对丰度。
5. 放线菌噬菌体及其宿主的时空动态
由于放线菌以及其噬菌体的高丰度分布特征，该研究着重分析了噬菌体基因组及放线菌基因组特征。放线菌噬菌体（125个）在不同样本中的相对丰度如图4所示，其中相似度和覆盖度高于95%的噬菌体被认为是一个簇，结果发现同一个簇的基因组信息基本相同，但不同簇之间的基因组信息差异较大，证明噬菌体会侵染不同的放线菌。
同时该研究还重组了305个放线菌基因组（基于MetaBAT2），基于19个标记基因的进化树显示（图5），该生态系统中的放线菌属于三种类型：'Ca. Nanopelagicales’ (n=280), Acidimicrobiia (n=114)和Microbacteriaceae (n=37)。Ca.Nanopelagicales和Acidimicrobiia的相对丰度普遍在深水层较多，但是Microbacteriaceae的相对丰度普遍在浅水层较多。其中也存在特殊情况，即使在系统发育上接近的基因组不一定表现出相似的丰度模式，这意味着即使在同属内，个体之间也存在生态位差异。
在相对丰度变化上，噬菌体在浅水层的变化要比深水区大，噬菌体在深水层的变化与宿主的变化相似，均表现出较为稳定的变化趋势，说明浅水层宿主微生物随时间的变化而变化，而深水层的宿主微生物已经适应了长期低温的环境趋于稳定。
图4 来自Římov水库放线菌噬菌体的丰度特征（125个）。由内到外的环代表噬菌体基因组平均大小，GC%，采样位置的温度。
图5来自Římov水库放线菌丰度特征（350）。进化树是通过已知205个参考基因组和305个重组基因组组成。由内到外的环代表物种分类、进化分支、采样位置的温度；黄色、红色和绿色五角星代表基于16S rRNA的分类结果。进化树中线条的颜色代表不同的Bootstrap支持度（黑色>95; 红色45-95；灰色<45）。
评论
该研究通过宏基因技术研究了淡水系统中噬菌体的物种分类以及时空分布特征，补充了对病毒组的认知空白，推动了相关领域的发展。但目前针对“宏病毒组”的研究尚属于起步阶段，病毒物种、功能注释的可用数据库较少且覆盖度较低，例如本研究仅有少部分得到物种和宿主注释，导致对病毒或噬菌体的认知较浅。另外，该研究通过过滤的方式研究了0.22-5μm大小的噬菌体，忽略较小或较大的其他病毒，同时也侧面反映目前样本中病毒的回收方法并不成熟。未来，更全的可用数据库，更完善的样本处理及分析方法会大大增加人类对生态系统中病毒的认知。
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