编译：滕应，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
多环芳烃（PAHs）污染土壤的修复已经成为亟需解决的重要环境科学技术问题之一。微生物修复因其经济有效、环境友好等特征，已成为污染农田土壤的主要修复手段。通常纯溶液培养体系中微生物对有机污染物的降解效果远高于实际土壤培养体系，这表明了土壤组分能够显著影响微生物与有机污染物间的相互作用。作为土壤中较活跃的组分，土壤胶体能够显著影响土壤中有机污染物的迁移与归趋以及微生物活性与修复能力。而土壤无机胶体占土壤胶体颗粒的90%以上，其对有机污染物微生物降解过程会产生哪些影响作用及其内在影响机制如何？此问题已成为当前土壤环境微生物修复领域研究的热点和难点之一。
中国科学院南京土壤研究所滕应研究员课题组选取了我国分布广泛的红壤中含量丰富、性质活跃的赤铁矿作为一种代表性无机胶体，深入研究了赤铁矿胶体对高分子量多环芳烃苯并[a]芘（BaP）微生物降解的影响及其界面作用机制。
原名：Influencing mechanisms of hematite on benzo(a)pyrene degradation by the PAH-degrading bacterium Paracoccussp. Strain HPD-2: Insight from benzo(a)pyrene bioaccessibility and bacteria activity
译名：赤铁矿胶体对噬氨副球菌HPD-2降解苯并[a]芘的影响机制：着重研究对苯并芘生物可给性与细胞活性的影响
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：7.65
发表时间：2018.10
通讯作者：滕应
1.赤铁矿胶体制备与菌株HPD-2活化
在实验室内合成赤铁矿，并用沉降虹吸法选取<2.0 μm的胶粒。将保存于-80 ℃甘油管的HPD-2菌株接入LB培养基活化培养，经MSM清洗并稀释至OD≈1.0的菌液，备用。
2.BaP降解实验和细胞活性的测定
采用液体摇瓶实验，对赤铁矿胶体影响BaP降解的影响进行研究，同时考察降解过程中HPD-2的CFU，设置对照实验。
3.赤铁矿胶体对BaP生物可给性的影响
采用批吸附实验绘制赤铁矿胶体对BaP的吸附等温线；利用50 mM羟丙基-β-环糊精考察赤铁矿胶体对BaP生物有效性的影响；采用批吸附实验考察死/活细胞对BaP的吸附差异；利用双光子激光共聚焦显微镜（TP-CLSM）成像直观表征BaP在不同体系内的分布。
4.分析手段与方法
利用LIVE/DEADBacLight考察赤铁矿对HPD-2活性的影响；降解过程中细胞内外Fe的分布利用NanoSIMS进行定性分析；产生的ROS利用ROS-Kit和EPR进行表征；BaP的分布利用双光子显微镜（TP-CLSM）成像直观表征。
1.赤铁矿胶体对菌株HPD-2降解BaP效率和细胞活性的影响
不同质量浓度的赤铁矿对菌株HPD-2降解BaP（初始浓度为10 mg L-1）的结果如图1A）所示。作为对照，在没有赤铁矿的存在下，7 d后菌株HPD-2对BaP的降解效率可以达到60%，和前人的研究结果相似(毛健等, 2008)。当加入赤铁矿的质量浓度分别为5 mg mL–1、10 mg mL–1和20 mg mL–1时，BaP的降解效率分别为45.8%，32.8%和20.8%。加入5 mg mL–1赤铁矿对BaP的降解同对照组比没有显著性差异，当加入更多的赤铁矿时，BaP降解的抑制率明显增加（P<0.05）。说明赤铁矿能够显著抑制菌株HPD-2对BaP的降解，且随着赤铁矿质量浓度的增加，BaP降解受到的抑制越强。如图1B所示，培养3 d后，不加赤铁矿时的CFU为4.51×107 mL–1，但加入5 mg mL–1，10 mg mL–1和20 mg mL–1赤铁矿后，相应的CFU减少至3.23×107，1.69×107和5.80×106 mL-1。CFU的测定结果和BaP的降解效率表现出类似的趋势，不加和加入5 mg mL–1赤铁矿，CFU的测定结果没有显著的差异（P>0.05），但加入10 mg mL–1赤铁矿时表现出显著的差异（P < 0.05）。与不加相比，加入20 mg mL–1的赤铁矿能够显著抑制细菌的活性，且加入赤铁矿的量越多，抑制强度越高。降解过程中的CFU测定结果同BaP降解率成正相关。利用LIVE/DEAD激光共聚焦成像进行验证，表明相互作用6 h后，赤铁矿对HPD-2细胞具有明显的致死作用。
图1. 降解7 d时，BaP降解率（A）和细胞CFU（B）
2.赤铁矿胶粒与菌株HPD-2细胞的界面作用
赤铁矿胶粒对细胞的吸附是自发的，静电作用力在相互作用中起主导作用（图2A），与细胞间形成了作用较强的P-OFe化学键（FTIR）。从FE-SEM图像（图2B）中可以看出，在作用2 h时，赤铁矿没有完全包被菌株HPD-2细胞。而作用6 h后，整个菌株HPD-2细胞被赤铁矿胶粒包被，且通过TEM图像可以看出，赤铁矿可以刺穿菌株HPD-2细胞膜。因此，赤铁矿胶粒可以通过包被和强烈的相互作用破坏细胞的结构进而对细胞的活性产生影响。鉴于上述菌株HPD-2菌较高的致死率，单纯的强烈作用似乎不是唯一的致死原因，可能还存在其他的致死机制。
图2. HPD-2细胞与赤铁矿胶体界面作用。A. Ex-DLVO理论；B. FE-SEM/TEM图像
3. 赤铁矿介导下体系内持久性自由基（EPFRs）的生成
通常情况下，好氧微生物能够对氧化酶的验证具有阳性。而菌株HPD-2细胞也能利用葡萄糖作为唯一碳源进行生长，且利用葡萄糖氧化酶试剂盒进行验证，该菌确实存在氧化酶活性。之前也有副球菌具有氧化酶活性的报道。在有氧的条件下，氧化酶可以通过以下路径产生H2O2。这意味着赤铁矿的存在可与加氧酶产生的H2O2构成类芬顿体系，催化产生一些活性自由基，进而可能影响菌株HPD-2的活性。为了评估降解过程中可能产生的H2O2对细胞活性的影响，进一步测定添加与不添加赤铁矿的降解体系中H2O2。运用ROS-Kit直观表明加入赤铁矿后，降解体系内有ROS的生成（图3A）：赤铁矿能够释放溶解Fe（图3B），经赤铁矿作用后的胞内56Fe/12C参数的比值远远高于CK（P<0.01），致使降解体系内的HPD-2细胞胞内Fe含量远高于CK（图3C）；同时由于副球菌的氧化酶活性能够催化产生H2O2；在长期稳定的体系中，在过渡金属、多环芳烃的介导下，产生了持久性的自由基（图3D未加DMPO捕获图），这一结果进一步说明赤铁矿参与了降解过程中EPFRs（对菌株HPD-2具有较强的毒害作用）的生成。进而抑制HPD-2细胞的活性。
图3. 体系内持久性自由基（EPFRs）的生成。A. ROS-Kit荧光显微镜图； B. 溶解态Fe的释放与H2O2的生成；C. NanoSIMS直接表征赤铁矿对胞内Fe的贡献；D. EPR图谱。
4.赤铁矿胶体对BaP生物可给性的影响
除了研究赤铁矿影响菌株HPD-2的活性外，还需要考察赤铁矿对BaP生物有效性的影响。考察生物有效性则必须要研究赤铁矿与BaP的相互作用。赤铁矿对于BaP的等温吸附模型较好的符合朗格缪尔模型模拟最大理论吸附量（Qm）约为6.04 μg g−1，远远小于已有文献报道的黏土矿物和有机质对BaP的吸附量（图4A）。图4B说明对于高质量浓度的BaP，赤铁矿对BaP的生物有效性没有直接影响。考虑到赤铁矿对菌株HPD-2细胞的致死性以及死活菌对BaP的吸附差异，因此不能只单纯的考察生物多样性，要对三者在统一体系下进行综合的分析。首先，要同时考察死细胞与活细胞对BaP的等温吸附，并对可能存在的吸附差异进行比较。结果显示，死细胞对BaP的吸附强度远远高于活菌（如图4C），这是因为细胞死亡后为BaP的吸附暴露了更多的吸附位点，细胞死后胞内的大分子聚合物暴露出来，相当于变成了有机聚合物，持续死亡的死细胞对BaP的吸附则类似于天然有机物对BaP的吸附。利用TP-CLSM分别对只加赤铁矿、只加菌、加入赤铁矿+活菌、加入赤铁矿+死菌后BaP的分布进行观察，结果如图4D所示。只加入赤铁矿的体系中荧光强度很弱，几乎没有，说明赤铁矿对于BaP的吸附很弱，与等温吸附的结果一致。而只加入菌株HPD-2的体系中荧光强度最强，这说明菌株HPD-2细胞对BaP具有较强的吸附作用，而且在较短时间就能发生吸附。有意思的是，当体系中混加了赤铁矿后，体系的荧光强度减弱，菌株HPD-2对BaP的接触减少，这可能是由于赤铁矿占据了菌株HPD-2细胞大量的吸附位点甚至包裹，使之与BaP隔离，减少了菌株HPD-2细胞对BaP的吸附。对于死细胞来说，荧光强度高于菌株HPD-2活细胞，说明死细胞对BaP的作用比菌株HPD-2活细胞高，而且细菌失活后会使其Zeta电位的电负性减小，使得其与赤铁矿的相互作用减少，进而赤铁矿降低了死菌对BaP吸附的干扰。HPD-2对BaP的初步降解起作用的酶为双加氧酶，而双加氧酶是一种胞内酶，若对BaP进行初步降解，则BaP首先得与菌株HPD-2的活细胞接触，然后进入细胞进行初步的降解。综上，赤铁矿与BaP的相互作用远远弱于菌株HPD-2对BaP的相互作用。赤铁矿的加入减少了菌株HPD-2活细胞对BaP的有效接触，进而BaP的降解效率受到抑制。另一方面，赤铁矿对于菌株HPD-2的致死作用，使得更多的BaP集中到死细胞中，进一步减少了菌株HPD-2活细胞对BaP的有效接触，导致胞内的双加氧酶不能对BaP进行初步的降解。同时，赤铁矿的加入减少了活菌细胞对BaP的有效接触，也能够抑制BaP的降解。
图4. 赤铁矿对菌株HPD-2降解BaP影响界面作用机制示意图。A. 赤铁矿胶体对BaP的等温吸附； B. 环糊精对BaP在赤铁矿中老化0, 15和30天后的提取效率；C. 死/活菌对BaP的等温吸附；D. TP-CLSM原位观察BaP的分布。
5.影响BaP降解机制的探讨
根据以上结果的讨论，进一步刻画了赤铁矿胶体影响菌株HPD-2降解BaP的界面作用机制示意图（如图5所示）。从图中可以看出，赤铁矿可以通过强烈的相互作用（包括包被作用）使细胞变形，还可以破坏细胞生物膜等最终使得细胞活性下降甚至死亡。双加氧酶作用下产生的H2O2被赤铁矿贡献的胞内Fe进一步催化产生ROS，EPFRs（ROS）可以在赤铁矿-BaP-菌株HPD-2的体系中持续产生，并稳定存在。ROS可以通过氧化DNA、蛋白质来破坏生物膜，进而对菌产生致死作用。同时赤铁矿的加入，通过竞争吸附位点减少了菌株HPD-2细胞对BaP的接触，而且因其致死的细胞比活细胞对BaP有更强的吸附力，最终导致更多的BaP集中到了死细胞中，造成菌株HPD-2的活细胞对BaP的有效接触减少。总之，赤铁矿对菌株HPD-2降解BaP的抑制机制表现为以下三个方面：（1）赤铁矿胶体与菌株HPD-2之间可以通过强烈的相互作用，如包被作用使细胞变形，从而破坏细胞生物膜使得细胞活性下降甚至死亡；（2）双加氧酶作用下产生的H2O2被赤铁矿贡献的胞内Fe进一步催化产生持久性自由基，对降解菌产生致死作用；（3）通过竞争吸附位点减少了菌株HPD-2细胞对BaP的接触，而且因其致死的细胞比活细胞对BaP有更强的吸附力，最终导致更多的BaP集中到了死细胞中，造成菌株HPD-2的活细胞对BaP的有效接触减少。
图5. 赤铁矿对菌株HPD-2降解BaP影响界面作用机制示意图
本研究运用NanoSIMS与TP-CLSM等技术综合分析了个体细胞、BaP分子以及矿物胶粒间的相互作用，从分子水平上揭示了赤铁矿对降解菌降解BaP的界面抑制作用，为研究其它无机胶体和实际土壤无机胶体对微生物降解有机污染物提供了方法的指导和参考，研究结果为多环芳烃污染土壤微生物修复提供重要理论依据，为我国南方红壤地区有机污染微生物调控修复提供新的思路。
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