科研 | PLANT PHYSIOLOGY：酸性生长环境对大豆结瘤的系统调控
编译：沙子，编辑：小菌菌、江舜尧。
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土壤低pH导致豆科植物如大豆、小扁豆和豌豆的根瘤数量减少超过90％，根瘤干重降低超过50％。然而，某些豆科植物如羽扇豆属和含羞草属在高酸性的巴西Cerrado和Caatinga生物群落中表现出结瘤的耐酸能力。有限和无限型根瘤均受低pH影响。低土壤pH导致的结瘤和生物固氮损失量占全世界酸性土壤普遍存在的大豆主产区每年施用360万吨氮肥的75％，见图1。为了应对这一严重问题，有必要细致了解酸性土壤调控根瘤的分子机制。
酸性土壤导致根瘤减少不仅是由于阻碍了植株的发育，还限制了根瘤菌的生长、持久性和功能。低pH值主要通过增加质子浓度，导致土壤中可溶性金属离子浓度升高，造成细胞内部pH值不稳定而限制细胞功能。
酸性条件下不同根瘤菌属的共生效力不同，快生型的耐酸性较慢生型高，而相应的机理尚不明了。并且，某些菌系在中性环境下共生效力非常低，但在酸性条件下则排斥。酸性条件下，根瘤菌结瘤基因的表达和结瘤因子的产生均受到抑制，扰乱了寄主植物与根瘤菌之间的信号交换，根毛变形和卷曲减少，外源施用结瘤因子和异黄酮可以在一定程度上起改善作用，但并不能完全恢复根瘤数量，没有实际生产意义。
根瘤菌需要依靠Ca2+附着豆科作物根毛上，然而低pH条件限制了土壤中Ca2+的可用性，影响根瘤菌附着、侵染和侵染线的形成。土壤低pH值也可显著影响根毛侵染之后或者与之同步进行的其它根瘤发育过程，包括细胞分化和原基形成。
豆科作物自身具有内部调控机制，被称为结瘤自动调节。在AON中，根瘤原基形成的开始触发根系中CLE肽的产生。这些类激素的肽（大豆中的GmRICs）由根系到达地上部，并推测与结瘤自动调节受体激酶（大豆中的GmNARK及其在其他物种中的其直系同源基因MtSUNN，LjHAR1和PsSYM29相互作用，产生抑制化合物并被转运至根部，抑制根瘤的进一步形成。
有趣的是，对根瘤形成起强抑制作用的硝酸盐也可触发大豆中CLE肽的产生，称为GmNIC1。然而，这种CLE仅在根部通过GmNARK抑制根瘤形成，而非通过地上部的系统调控。
论文ID
原名：Systemical Regulation of Soybean Nodulation by Acidic Growth Conditions
译名：酸性生长环境对大豆结瘤的系统调控
期刊：PLANT PHYSIOLOGY
IF：6.305
发表时间：2018.11
通讯作者：Peter M.Gresshoff
作者单位：昆士兰大学植物生物学系
图1.全球土壤pH值和主要大豆产区（以黑色圆圈表示；黑框表示2011年区域产量（公吨）；Soystats 2012：美国大豆协会）。大豆主产区主要位于低pH区域。该地图改编自生物圈地图集（威斯康星大学麦迪逊分校可持续发展和全球环境中心）。
实验设计
1 植物生长条件
选用两个野生型大豆品种BraggandWilliams82，以及超级结瘤大豆突变体Gmnarkmutant——nod4为试验材料。大豆种子用70％乙醇中完全浸泡30s进行表面灭菌，随后用无菌水冲洗五次。除非另有说明，将大豆种子播种于无菌蛭石中。选用蛭石做基质，因为它具有部分缓冲能力，使酸处理可以在不明显损害植物的情况下进行。
每2天用改良的Herridge营养液浇灌大豆幼苗：KH2PO41mM；K2HPO4 1mM；MgSO47H2O 2mM；KCl 1.5mM；CaCl22H2O 2.5mM；Fe（III）-EDTA 34.8mgL-1；H3BO3 2.86mgL-1；MnCl2·4H2O 1.812mgL-1；ZnCl2 0.112mgL-1；CuCl2·2H2O 0.052mgL-1；Na2MoO4·2H2O 0.024mgL-1。使用5M HCL调节溶液的pH，并且每2天浇灌300mL。在28℃/23℃下分别使用16小时/8小时的周期来控制温室生长条件。除非另有说明，否则所有植株在接种后18天进行取样和测量。对于干重，将植株器官放置在60℃的烘箱中烘干4天，然后称重。除非另有说明，每个pH处理包括15株大豆植株。
2 不同pH值变换试验
每隔2天用6.8或4.0pH溶液处理6d大的幼苗（n=15），至8d时接种快生型菌株CB1809。在接种后的不同时间（12、24、48或96小时），从不同pH值处理的植株中选取一部分用相反的pH值溶液冲洗（即pH变换），随后每2天用变换的pH溶液对上述材料连续处理至接种后第18天，直至取样。
3 pH和铝毒性试验
采用AlCl3溶液模拟铝胁迫，以Bragg为材料，设置不同pH(300mLpH6.8，5.0，或者4.0)与不同浓度AlCl3（300mL的0、1、10和100μm）交互处理，在第8天接种根瘤菌株CB1809。各处理每2天供应相应的溶液，连续18d至取样。
4 分根和嫁接试验
以Bragg为供试品种，经表面消毒后，播种于4L盆中。当幼苗达到3日龄时，将幼苗拔出并用无菌手术刀片从根尖切下3mm以促进侧根发育。被切除根尖的幼苗快速立即嫁接到的50mL试管中，试管底部被切掉形成截面直径7cm的洞，如图5-B所示。嫁接后7天，幼苗根系发育并扩展至两侧塑料盆。在嫁接后第14d进行酸处理，并于酸处理的第2d用100ml的CB1809菌液接种，每2d淋浇1次相应营养液，连续处理18d直至取样。
对于野生型与突变体相互嫁接试验，选用品种Williams82和nod4，对已经完成分根7d的两个品种进行相互嫁接。具体的嫁接过程参考Delves等（1987年）的方法，将嫁接的植株用透明塑料袋套上，浇水以保持较高湿度，进而促进嫁接体系的形成。嫁接7天后，去掉塑料袋并开始酸处理，在酸处理的第2天用100mL的CB1809菌液接种。每2天淋浇1次相应营养液，连续处理14d直至取样。
5 根系组织取样与基因表达分析
用解剖显微镜观察各处理植物的根，以记录第一次出现的根毛和完全成熟的根毛之间的区域，并取样该区域用于基因表达研究。所有收集的样品立即在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。按照制造商的说明书使用TRIzol试剂（Invitrogen）进行RNA提取。
6 定量RT-PCR
本研究中使用的qRT-PCR引物列于表1中。SYBRGreen（AppliedBiosystems）通过使用EppendorfepMotion5075机器人系统分配到384孔板上进行反应。qRT-PCR和分析在ABIPrism7900序列检测系统（AppliedBiosystems）上进行40个循环，温度为60℃，每个反应重复进行。热循环条件如下：初始95℃10分钟，然后40个循环的95℃15秒，60℃1分钟和95℃2分钟（解离阶段以验证引物特异性）。使用LinRegPCR7.5软件确定每个反应的PCR效率。GmATP合成酶和GmCons6作为内参基因。
表1 定量PCR所选基因和引物设计
7 统计分析
结果
1 酸性胁迫抑制大豆结瘤
为了评估酸性条件下大豆植株的适应性和结瘤效率，设置了一定范围的pH值条件（pH6.8-4.0，所有pH值表示所提供的营养液的酸度，而不是根际pH。pH6.8处理总根瘤数量（接近中性对照）最高，根瘤数量随着pH的降低而减少（图2）。pH5.5-4.0范围处理根瘤数量接近，可能是由于蛭石的缓冲/离子交换作用的缓冲作用所导致。
图2. pH6.8至4.0（A-D）和pH4.0至2.0（E-G）酸胁迫下大豆结瘤和发育。通过pH6.8至4.0的溶液实现酸性pH控制大豆植株的结瘤（n=10）。A，地上部干重（DW）。B，根干重。C，单株根瘤数量。D，单位根干重下的根瘤数量。E，地上部干重
2 结瘤早期的酸抑制
为了确定酸胁迫影响结瘤发育的阶段，将大豆植株置于较为良好（pH6.8）或酸性（pH4.0）条件下，并在接种后（hpi）12、24、48和96小时将处理的植株改用相反的溶液淋浇，对照材料一直保持相同pH值的溶液供应。在整个实验过程中对照植物保持在相同的pH值。在接种后96小时或更早时间内，pH从良好条件变化到酸性条件导致结瘤受到抑制（图3），96小时以后结瘤进入不敏感阶段。相反，在任何时间点pH从酸性条件变化到良好条件、甚至在接种12小时都不能恢复正常根瘤数量（图3）。
图3.pH变化后的大豆根瘤数量。数值显示在接种B.japonicum后，在不同时间点从良好条件（pH6.8）转变为酸性（pH4.0）条件（A）或从酸性条件转换为良好条件（B）的根瘤数（n=8）。DW，干重;nt，未转变。误差线表示SE。条上方的不同字母表示统计学显着性差异（Student'st检验；P=0.05）。
3 低pH对生长在蛭石中的大豆结瘤的抑制作用与Al3+毒性无关
由于Al3+毒性是酸性土壤中引起作物生长和产量减少的主要因素，因此针对酸导致的Al3+毒性对大豆中结瘤中的影响进行了研究。酸处理（pH 6.8、5.0和4.0）伴有不同浓度AlCl3（0、1、10和100μmM）用来模拟不同酸性土壤条件，随着pH降低和Al3+浓度增加（图4），单株根瘤数量和单位根干重对应的根瘤数量随之下降。然而，Al3+抑制结瘤与pH无关（图4），酸处理和Al3+联合处理对根瘤的抑制程度并不强于单独酸处理，（图4），这表明在本实验条件下，Al3+并未进一步抑制酸胁迫下大豆植株结瘤。
图4.不同pH条件下铝导对大豆结瘤的抑制作用。 A，单株根瘤数量。 B，根干重（DW）。 C，单位根干重下的根瘤数量。处理包括0,10或100mM AlCl3+浓度与pH 6.8,5.0或4.0交互，（n= 8）。 误差线表示SE。条上方的不同字母表示统计学显着差异（Student'st检验；P=0.05）。
4 酸胁迫通过地上部系统地抑制结瘤
为了明确酸胁迫对结瘤的抑制作用是整体的还是局部的，采用大豆分根设计进行研究。当分根系统两侧pH相同时，两侧的根瘤数量相近（pH6.8或4.0;图5），并且pH6.8处理高。分根系统的两侧分别供应pH6.8和4.0的溶液时，两侧的根瘤数量也接近。上述结果表明，低pH对结瘤的抑制作用属于局部调控，同时也属于根系——地上部——根系的系统调控，类似于根瘤菌诱导的AON机制(Delvesetal.,1986)。
图5.分根系统下低pH胁迫对大豆结瘤的系统效应。A，分根系统两侧不同pH条件下根瘤数量（n=8）。误差线表示SE。条上方的不同字母表示统计学显着性差异（Student'st检验;P=0.05）。DW，干重。B，分裂根装置包括跨越两个独立盆的切割的15mLFalcon管。
5 酸性生长条件通过NARK受体抑制结瘤
为了进一步明确低pH条件对结瘤的系统影响，利用超级结瘤大豆GmNARK突变体nod4为材料（Alvaetal.(1988)通过水培试验已经证明另一个GmNARK突变体——nts382并未受pH4.0的影响）进行研究。同样，本试验结果显示pH4.0处理未能减少等位基因nod4突变体大豆植株的根瘤数量，而与用pH6.8处理相比，pH4.0处理显著减少了野生型大豆植株的根瘤数量（图6）。
图6.酸性条件对超级结瘤大豆的影响。数值显示的是野生型大豆品种Williams82和其超级结瘤大豆GmNARKmutant,nod4(V370D)突变体在在pH6.8或4.0条件下的单株根瘤数量。n=8。错误条表示SE。条上方的不同字母表示统计学显着差异（Student'st测试；P=0.05）。DW，干重。
6 胁迫对结瘤的系统性抑制机制同时依赖GmNARK基因
和地上部调控为了明确酸抑制结瘤过程中不同基因型大豆地上部的调控作用，开展了不同基因型大豆品种、嫁接和分根相结合的试验。分根试验选用了两个野生型大豆品种和近等位基因系GmNARK(nod4)突变体，将上述品种相互移栽组合，用pH6.8或4.0的溶液分别处理。与pH6.8处理相比，pH4.0处理显著减少了接穗/砧木为野生型/野生型为嫁接形式的大豆单位根系干重下的根瘤数量，并且一侧pH4.0处理显著减少另一侧pH6.8处理的根瘤数量，而对接穗/砧木为Gmnark/Gmnark嫁接形式的大豆植株根瘤未受影响（图7）。
图7.pH6.8或4.0处理下相互嫁接的分根系统大豆植株根瘤数量。以野生型大豆品种cvWilliams82（WT）及其超级结瘤突变体nod4（Gmnark）为接穗或砧木进行嫁接。n=10。误差线为SE。条形上方的不同字母表示统计学显着性差异（Student'st检验；P=0.05）。DW，干重。
7 低pH条件调控结瘤发育早期基因表达
为了明确酸性条件对根瘤发育相关功能基因的影响，分别在接种后24，96和336h取样pH6.8和4.0处理的根系，采用(qRT)-PCR方法进行结瘤相关基因的定量表达分析。取样时选择根瘤侵染敏感区域，此区域可有效用于测定早期结瘤基因的表达，并减少其他mRNA稀释作用的干扰。与pH6.8处理的对照相比（图8），pH4.0处理抑制了根瘤发育基因（表I;GmENOD40b，GmNIN-2b，GmRabA2和GmTIR-NBS-LRR）的表达，这表明低pH值的抑制作用在根瘤发育很早阶段就已发生，甚至可能在结瘤因子识别之后随即起作用。
同时还对编码三种CLE肽基因的表达进行了研究，根瘤菌接种可以上调了GmRIC1和GmRIC2表达量，并通过地上部GmNARK抑制根瘤发育。GmNIC1可由氮诱导上调表达，并作为硝态氮通过GmNARK调控根瘤形成的一部分途径。由于本研究发现酸胁迫也通过GmNARK调控大豆结瘤，故开展了基因表达研究以明确低pH是否通过调控上述基因的表达来控制结瘤，结果显示酸处理未对上述基因起上调作用，GmRIC1和GmRIC2表达量反而下降了，这可能是由于酸处理减少了根瘤原基的形成所致。
图8.结瘤基因表达对酸处理的直接响应。数值为pH6.8或4.0处理的大豆在接种根瘤菌后不同取样时间根ZON区域结瘤基因GmRabA2，GmENOD40b，GmNIN-2b，GmTIR-NBS-LRR，GmRIC1，GmRIC2和GmNIC1的相对转录丰度，n=10。错误条指示SE。条上方的不同字母表示统计学显着性差异（Student'st检验；P=0.05）。
8 低pH条件系统性地调控结瘤基因的表达
为了进一步明确酸对结瘤的系统影响，测定了分根系统ZONS区域早期结瘤基因GmNIN-2b，GmRIC1，GmRabA2，GmCytochromeP450(TableI)的表达量，这些基因在结瘤早期上调表达。分根系统的两侧分别用pH6.8或4.0处理48小时后接种野生型（+，有效，对照）和（2，无效，不能合成Nod因子）突变体根瘤菌，设置6.8+/6.8+，6.8+/4.0+和6.8+/4.02三种处理组合。于接种后48小时取样各处理根系ZONS区域，采用qRT-PCR进行基因表达分析。
进一步检测酸胁迫对结瘤的系统性影响，在分根植株的ZON中检查了早期结瘤基因GmENOD40b，GmNIN-2b，GmRIC1，GmRabA2和GmCytochromeP450（表I）的表达（图9）。这些基因是根据其早期结瘤反应选择的。分根植株的每一侧用pH6.8或4.0处理，48小时后接种与B.japonicum野生型（+；有效，对照）或其nodC2突变体（2；无效，不能合成Nod因子）。三种处理组合是研究：6.8+/6.8+，6.8+/4.0+和6.8+/4.02。使用qRT-PCR48小时收集根系ZON区域用于基因表达分析。
图9.早期结瘤基因响应系统性酸处理的表达。数值为pH6.8或4.0处理、接种48小时后分根系统中大豆根系ZON区域早期结瘤基因GmRabA2，GmENOD40b，GmNIN-2b，GmCytochromeP450和GmRIC1相对丰度。n=10。错误条指示SE。不同条上方的字母代表统计学显着性差异（Student'st检验；P=0.05）。
讨论
本研究结果显示，低pH通过受体激酶GmNARK系统地由地上部抑制根瘤发育。酸抑制作用在根瘤发育早期即起作用，显著减少了酸处理0至96小时内接种根瘤后根瘤数量（图3），这与豌豆和大豆的报道是一致。一旦发生酸胁迫，即使少于12h恢复到较适宜的pH条件也不能逆转低pH对根瘤的抑制作用。而在96小时后，将大豆植株转移至低pH条件未观察到根瘤被抑制，这一时期与所谓的根瘤原基发育阶段相吻合，具有发育自主性，同时AON也在大豆的这一时期起作用。上述结果表明，根瘤原基（分生组织）发展到一定阶段就不再受酸处理的调控。
低pH环境下，酸通过降低结瘤信号途径中与结瘤重要相关基因的表达起抑制作用（图8）。结合本研究中生理、基因和发育相关结果认为，酸对根瘤形成的起始阶段起作用，这一结论支持了Indrasumunar等的研究结果，即结瘤因子受体蛋白组分基因GmNFR1a、而非GmNFR1b、GmNFR5a或GmNFR5b异位过量表达不仅能够增加单株根瘤数量，还能促进大豆在酸性土壤条件下（pH4.6）获得与正常条件下野生型相同数量的根瘤。
GmNARK上调途径直接导致基因表达的长距离抑制，而低pH值对植株和根瘤菌生长起抑制作用，并减少异黄酮和结瘤因子的合成，本试验还明确了低pH值下调了早期结瘤相关基因的表达（图8和9）。与此同时，低pH值导致的氧化胁迫造成乙烯、活性氧和茉莉酸积累也起到不利影响。
酸通过GmNARK（图5和图6）对结瘤起抑制作用这一现象是可以预见的，Alvaetal.(1988)在先前的报道中已经提出了这一观点。但是GmNARK参与的时间点并不清楚，也未被确定，其作用的系统性也未被明确。而这对于硝态氮通过GmNARK的根系局部调控模式抑制根瘤发育非常重要，因此酸胁迫也能通过相同的局部调控机制控制根瘤形成。很长一段时间，研究人员认为低pH值导致过量H+会对作物和根瘤菌，以及它们之间共生互动起到弱化作用，但这仅是pH值调控结瘤的一个方面。
本研究利用大豆和根瘤菌突变体，采用分根和嫁接的方法，通过测定表型和基因表达细致地研究了pH值抑制结瘤的系统本质，其最终影响结果是大豆根际对非生物胁迫的反应，以及多种内部调节机制的协同互作（图10）。其中最重要的是存在活跃的系统性抑制机制，即长距离信号抑制根瘤的发育途径，这为解决广泛存在的土壤酸化提供了新的目标和途径。
图10.低pH值抑制豆科作物结瘤的相互作用组分和调控目标模型。ROS，活性氧；SA，水杨酸；SDI，地上部来源抑制剂。
结论
评论
根瘤固氮对大豆生长发育、产量和品质的重要性众所周知，对于整个农业生态系统和可持续发展也具有举足轻重的作用。除自然条件外，不当的农事操作给农田土壤造成很大破坏、甚至是不可逆转的改变。尤其长期不适宜的施肥和灌溉策略对土壤质量的负面影响逐渐显现，克服负面影响对大豆根瘤形成和活性的限制，充分发挥根瘤菌在减少氮肥施用、改善农业环境方面的积极作用已经成为广大农业科研工作者不得不面对和解决的问题。
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