科研 | cell:致病性大肠杆菌利用注射性成分从感染宿主细胞中提取营养物质
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微生物菌群和肠上皮通过营养的快速消耗限制了病原体的生长。本研究探究了病原菌是如何绕过这一障碍在宿主上进行定居。以肠道致病性大肠杆菌（EPEC）作为研究对象发现，附着着的细菌可以从感染的宿主细胞中获取营养，这一过程我们称之为宿主营养提取（HNE）。我们确定了一个对HNE来说充分且必要的内膜蛋白复合体（以下称为CORE），该复合体是EPEC注射体的关键部件。本研究证明，其支持形成一种由膜纳米管组成，从EPEC表面凸出，直接与宿主接触的替代结构。注射体和鞭毛在进化上是相关的，都含有保守的COREs。基于研究结果，我们支持这样一种观点，即HNE是一种广泛的致病力策略，使病原体能够在竞争激烈的生态位中茁壮成长。
论文ID
原名：Pathogenic E. coli Extracts Nutrients from Infected Host Cells Utilizing Injectisome Components
译名：致病性大肠杆菌利用注射性成分从感染宿主细胞中提取营养物质
期刊：Cell
IF：31.398
发表时间：2019年
通信作者：Sigal Ben-Yehuda；Ilan Rosenshine
通信作者单位：希伯来大学（The Hebrew University of Jerusalem）
实验结果
1 宿主附着的EPEC消耗宿主衍生的氨基酸
考虑到EPEC与宿主细胞的紧密结合，我们假设EPEC可能通过从受感染的宿主细胞中吸取营养物质来克服自身的营养限制。为了验证这一假设，我们比较了游离的EPEC和被宿主附着的EPEC在缺乏氨基酸的情况下（饥饿情况）合成蛋白质的能力。为了达到这一目的，我们构建了一个缺少△proC的EPEC突变体，该突变体含有一个蛋白质合成的报告基因，该基因可以在异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的PTAC启动子下表达产生绿色荧光蛋白(GFP)。基于研究我们发现，当EPEC从丰富的培养基环境转移到缺少氨基酸或者最低浓度培养基环境时，将不再产生GFP。随后，设计了一种饥饿条件下感染EPEC △proC的实验（图1A），即在丰富的培养基中先进行感染，允许毒力因子的表达和宿主的附着，然后在无氨基酸的饥饿培养基中孵育以耗尽细菌的氨基酸库。之后添加IPTG诱导GFP表达，固定感染的细胞，并进行荧光显微镜分析；与此同时对未附着的细菌进行检测。通过实验发现，没有附着的细菌产生GFP受到抑制，但附着的细菌表达GFP水平较高，尽管野生型具有合成所有氨基酸的潜力，但当使用野生型EPEC代替△proC突变体时，同样得到类似的结果（图1C-E）。以上数据表明附着的EPEC具有从宿主细胞中获得氨基酸并利用它们来合成蛋白质的能力，我们称这种能力为宿主营养提取（HNE）。
图1 EPEC从感染宿主细胞中吸收氨基酸和Calcein。a表示氨基酸吸收试验；b-c表示氨基酸摄取量的量化；d-e表示氨基酸摄取实验的代表性图像；f表示EPEC从感染宿主细胞中获得Calcein；g表示Calcein摄取量的量化。
2 Calcein从宿主细胞质迁移到附着的EPEC的细胞质中
上述结果说明，氨基酸等小分子物质可以从宿主细胞迁移到感染的EPEC中。为了检验这种可能性，我们检测了该细菌从宿主中获得小分子荧光示踪剂钙黄绿素(Calcein)(分子量为0.62 kDa)的能力。HeLa细胞和能够进入细胞的非荧光乙酰甲氧基钙调素(Calcein-AM)共培养。当Calcein-AM进入细胞后，其AM基团被细胞内的酯酶去除，游离的Calcein保留在细胞质中并显荧光。而与HeLa细胞不同的是，EPEC缺乏能够水解AM基团的酯酶。随后，用细菌侵染含有Calcein的HeLa细胞（无论饥饿与否，均选择饥饿条件下进行）。由于含有Calcein的HeLa细胞产生强烈的荧光信号，从而影响了对原位感染细菌的分析。因此，我们分离了游离的非附着的细菌，同时对宿主细胞进行裂解，分别回收游离的非附着的细菌以及附着宿主的EPEC。基于荧光显微镜对这两个群体进行观察发现，被宿主附着的细菌获得了Calcein，由于饥饿条件可以加剧这一现象(图1F、1G)。这些结果提示HNE可能是由一种分子间的流动所介导的，即从宿主细胞质分子到依附的EPEC中去。
3 HNE允许附着的EPEC在饥饿条件下进行蛋白质的从头合成
为了进一步证实HNE的存在，基于细菌对氨基酸饥饿的响应，我们设计了一种额外的检测方法。该方法利用一个低拷贝数质粒(pSC101*)，表达一种由启动子(P1rrsB)驱动的不稳定的GFP(GFPtm)，当严格的反应激活时，GFPtm受到严格的抑制（图2A）。我们预测在饥饿状态下，被宿主附着的EPEC可以执行HNE并维持较高的GFPtm水平，而非附着的细菌则表现出抑制GFPtm的产生。为了验证这一想法，我们用含有GFPtm报告基因的EPEC在富集培养基中侵染HeLa细胞，然后将感染的细胞在饥饿培养基中培养、固定并在荧光显微镜下观察。研究结果表明，在非附着细菌中的GFPtm水平迅速下降，而在附着宿主的细菌中合成了GFPtm，并积累到较高水平（图2B-C）。这一现象表明，被附着的EPEC能够在饥饿状态下进行蛋白质的从头合成。为了研究GFPtm在宿主附着细菌中的积累是否源于蛋白质的从头合成，我们用时间间隔显微镜观察了单个EPEC细菌中GFPtm的合成。结果表明，在饥饿期间，最新附着在宿主上的EPEC累积了GFPtm，表明这些细菌进行了新的GFPtm的从头合成（图2D）。为了进一步证实这一假设，我们在光脱色(FRAP)之后对荧光进行了检测，以探究被附着的 EPEC是否保持了GFPtm的合成能力，而呈现绿色。基于显微镜观察发现，光脱色后的EPEC在一段时间后恢复了荧光，进一步验证了新的GFPtm合成(图2E)。
图2 HNE允许附着的EPEC在饥饿条件下进行蛋白的从头合成。a代表从P1rrsBGFPtm报告基因的GFPtm表达量；b代表用含有P1rrsBGFPtm报告基因的EPEC在DMEM条件下侵染HeLa细胞3h；c代表GFPtm表达量的量化；d表示用时间间隔荧光显微镜记录了饥饿条件下GFPtm在最新寄主附着的EPEC细胞内的积累情况(用圆圈表示)；e表示时间间隔显微镜的FRAP分析。
4 宿主营养物提取（HNE）需要肠细胞脱落位点（LEE）
为了探讨HNE是否是附着的病原菌的共同特性，基于P1rrsB-GFPtm报告基因检测了几株EPEC临床分离株的HNE能力。同时，我们以三株大肠杆菌K12的实验菌株为研究对象，辅以粘附素编码基因（以促进宿主的粘附），对HNE活性进行评估。所有被检测的EPEC分离株都可执行HNE，而在被宿主附着的E.coli K12菌株并未发现相似的结果(图3B)。基于以上结果，EPEC独特的表面成分促进了HNE。为了鉴定这一推测，我们采用缺乏表面特有成分的EPEC的突变体侵染上皮细胞。结果表明，仅有缺乏LEE区域的突变体△LEE在执行HNE方面有缺陷(图3A)，这说明LEE编码了该过程所需的元素。此外，我们在E.coli K12菌株中添加全部的EPEC LEE (pLEE)粘粒，以此菌株去侵染肠上皮细胞。通过实验可以发现，被宿主附着的E.coli K12/pLEE表现出GFPtm的高水平积累，说明其具有很强的HNE活性(图3B)。基于以上结果，我们有理由认为LEE所包含基因对HNE来说是必要且充足的。
图3 宿主营养物提取（HNE）需要肠细胞脱落位点（LEE）。a表示用野生型EPEC和缺少LEE区域的突变体△LEE去侵染HeLa细胞，这两种细菌均含有P1rrsB-GFPtm报告基因；b表示用含有P1rrsB-GFPtm报告基因的E.coli K12菌株W3110和含有LEE质粒的E.coli K12（K12/pLEE）侵染HeLa细胞3h。
5 CORE基因对HNE是必不可少的
为了探究HNE是否需要LEE基因，我们通过大量缺少编码注射组分的基因突变体来检测HNE的活性。这其中包括转运子组分（espA，espB，espD），外膜环蛋白（escC），内膜环蛋白组件(escJ，escD)，分泌型开关蛋白(sepL，sepD)和CORE蛋白(escRSTU，escV)。虽然上述每一个突变体都缺乏注射性，但除了escRSTUV突变体外，所有的突变体仍然能够执行HNE（图4A）。基于构建的EPEC菌株（称为△LEE:CORE，该菌株携带由LEE1原生启动子操作表达的特定的染色体escRSTUV操纵子，但缺少所有其他的LEE基因）(图4A)，我们发现，EPEC △LEE:CORE表现出高效的HNE(图4B)，这表明功能CORE是这一过程所必需且充足的。此外，添加pCORE-IEPEC的E.coli K12恢复了具有了执行HNE的能力(图4B)。这些结果强化了这样一个前提，即CORE是促进HNE所必需的。因此，除了其注射功能的任务外，CORE蛋白可能具有完全意想不到的、以前未被报道的作用，作为从受感染的宿主细胞获取营养的装置。
图4 CORE基因对HNE是必不可少的。a表示LEE组成成分，每个基因由一个箭头表示，相应的基因名称在下方表示；b表示用含有P1rrsB-GFPtm报告基因的细菌侵染Hela细胞3h随后饥饿条件下处理1h。
6 CORE基因表达诱导膜状纳米管的形成
CORE蛋白形成一个内膜复合体；然而，我们预测HNE需要一个跨越细菌包膜的结构，向外延伸到宿主细胞表面。为了检测与CORE基因表达相关的结构，通过对△LEE:CORE和△LEE菌株进行对比（均去除了形成鞭毛和BFP的能力），基于高分辨率扫描电镜(XHR-SEM)分析发现，从细菌表面不同位置延伸出来的管状突起在△LEE:CORE菌株中很容易被发现（图5A），同时，这些突起的形成在营养缺乏时得到加强。为了确定这些凸起是否具有与B. subtilis相似的膜特点，基于膜染料对△LEE:CORE和△LEE菌株进行了荧光显微镜观察，通过观察发现，被荧光膜染料染色的延伸结构是由△LEE:CORE产生的（图5B）。此外，基于免疫XHR-SEM对未包被的样品进行了分析发现，延伸的突起很大程度的被抗体修饰，说明这些延伸部分含有脂多糖（LPS）（图5C）。综上所述，我们的结果证实了CORE表达促进膜状纳米管形成的观点。
图5 CORE基因表达诱导膜状纳米管的形成。a表示缺少鞭毛和BFP的△LEE:CORE和△LEE两种菌株接种到EM网格上，放置于DMEM琼脂平板上3h，然后转移到饥饿培养基琼脂平板上；b表示缺少鞭毛和BFP的EPEC △LEE:CORE在DMEM培养基上生长然后在饥饿培养基中孵育1h；c表示缺少鞭毛和BFP的EPEC △LEE:CORE在DMEM培养基上生长，然后放置在圆形玻璃上，固定，用兔抗O 127抗血清标记，然后用金共轭的山羊抗兔抗血清标记；d表示缺少鞭毛和BFP同时辅以一个编码侵袭素的质粒的△LEE:CORE和△LEE两种菌株，分别感染HeLa细胞3h后饥饿1h；e表示缺少鞭毛和BFP但带有GFP标记的△LEE:CORE和△LEE两种菌株分别感染HeLa细胞3h后饥饿1h；f中侵染细胞方式同e中相同，时候回收游离的细菌，进行现场稀释试验，同时，被感染的细胞被清洗以去除未附着的细菌，并溶解以释放附着的细菌；g表示按照d中的步骤用△LEE:CORE菌株侵染HeLa细胞，用抗O127抗体标记。
7 在EPEC与受感染宿主细胞之间形成CORE依赖性的纳米管桥
HNE是由纳米管突出物介导的假说说明纳米管可以将EPEC连接到受感染的宿主细胞上。对感染EPEC △LEE:CORE和EPEC △LEE的细胞进行XHR-SEM分析发现，EPEC △LEE:CORE能有效地附着在宿主上，而缺少CORE的细菌很少与宿主表面结合（图5D）。荧光显微镜和宿主相关群落的形成进一步证实了粘附效率的显著差异（图5E-F）。这些观察表明，CORE有助于EPEC与宿主之间的连接。基于XHR-SEM进一步探究与宿主结合的EPEC △LEE:CORE发现，这些细菌凸起出的纳米管状可以将它们很好的固定在宿主膜上（图5D）。因此，我们的数据显示，依赖于CORE的纳米管桥链接了细菌和感染的宿主细胞，这意味着纳米管促进HNE过程。
8 缺乏CORE表达的细菌不能通过近端可表达CORE的细菌来执行HNE作用
HNE可能通过依赖于CORE的纳米管直接从宿主细胞质中提取氨基酸，除此之外，还可能以一种CORE依赖的方式通过消耗释放到宿主表面的营养物质来促进HNE的产生。为了区别这两种方式，我们用△LEE和△LEE:CORE按1：1混合后去感染HeLa细胞，在不考虑纳米管的生成与否的情况下，这两种细菌都可表达BFP以确保平等的宿主附着的能力(图6A)。为了同时检测这些菌株的HNE，采用两种不同的受体对HNE进行标记，一个基于GFP，另一个基于mCherry。分析表明，仅有CORE表达的EPEC具有HNE的能力，而位于其周围的△LEE细菌仍然缺乏HNE的能力(图6B和6C)。这些结果表明，缺乏CORE表达的细菌不能通过较近可表达CORE的细菌来执行HNE作用。因此，HNE极不可能涉及到宿主释放营养物质的消耗。
图6 HNE完全由CORE表达介导并与注射活性相关。a表示缺少鞭毛和BFP的△LEE:CORE和△LEE两种菌株侵染Hela细胞3h，然后饥饿1h，固定，镀金，用XHR-SEM进行分析；b-c表示△LEE:CORE和△LEE两种菌株按照1：1比例混合侵染Hela细胞；d代表用含有P1rrsB-mCherry-tm报告基因的EPEC感染HeLa细胞3h，以表示HNE过程(红色荧光)和nleA-gfp报告基因用于监测注射激活，从而导致效应器注射。
9 一个单独的EPEC细菌可以与效应剂注射一起执行HNE
感染EPEC执行两个CORE依赖的活动：与纳米管相关的HNE和由注射体介导的注入效应蛋白。这意味着，每个EPEC细菌要么同时执行这两种活动要么执行其中之一。为了区分这两种情况，我们使用含有两个不同受体的EPEC菌株去侵染宿主细胞，这两个受体分别是可以用来监测HNE的P1rrsB-mCherry-tm，以及用于监测注射体活性的nleA-gfp。我们观察到所有显示注射体活性的细菌(即GFP表达的细菌)也都可以执行HNE(图6D)。尽管如此，我们可以很容易地确定宿主连接的EPEC执行了HNE能力，但缺乏注射性激活的信号(图6D)。因此我们得出结论，大多数细菌的HNE过程和效应器注射是同时进行的。
10 不同谱系的CORE复合物支持了可执行HNE的EPEC △LEE突变体
考虑到核心成分的高度保守性，我们提出问题：执行HNE的能力是EPEC注射体CORE(CORE-IEPEC)的一个独特特征，还是来自不同谱系的CORE复合体的共同特征。基于以上问题，我们探究了不同CORE恢复EPEC △LEE突变体HNE活性的能力。通过构建两种不同的质粒CORE-ISPI-1和CORE-ISPI-2（两种毒力必要因子），基于实验发现，CORE-ISPI-1和CORE-ISPI-2都可以恢复EPEC △LEE执行HNE的能力(图7），表明这一过程并不是CORE-IEPEC特有的。接下来，我们对EPEC(CORE-FEPEC)和E.coli K12(CORE-FK12)的鞭毛核心基因(即fliPQR、flhBA)进行了检测发现，两者都能通过EPEC △LEE恢复HNE，其方式依赖于flio，一种编码鞭毛核心组装所需的伴侣（图7）。其次，我们探究了一个更遥远的CORE复合体，它来自革兰氏阳性细菌B.subtilis的鞭毛。在EPEC △LEE作用下，B.subtilis的CORE复合体(包括flio)显著地刺激了HNE的执行（图7）。在所附的论文中，我们发现不同的细菌利用其内源鞭毛核心复合物形成细胞间纳米管。综上所述，这些结果表明，不同的注射体和鞭毛的CORE支持HNE与纳米管的形成，突出了CORE的双重功能，可以作为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的一个鞭毛或注射性载体潜在的共同属性。
图7 不同谱系的CORE复合物支持了可执行HNE的EPEC △LEE突变体。
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