科研 | 肠道吉氏副拟杆菌通过产生琥珀酸和次级胆酸盐减轻宿主肥胖和代谢失常（国人作品）
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导 读
全微生物组关联分析(MWAS)揭示了肠道微生物与宿主生理有密切的联系，也发现了许多关联密切的微生物，但是这些微生物是如何对宿主产生影响的机制还不甚清楚。肥胖是当今社会最大的健康问题之一，也被认为是糖尿病、肝脏疾病、心血管疾病以及癌症的重要危险因素。虽然许多研究着眼于如何战胜肥胖，但是由于生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖患者有增无减。因此，急需寻找有效治疗肥胖及相关代谢异常的新策略。
有实验数据表明，肠道中副拟杆菌属的丰富与身体质量指数BMI负相关。吉氏副拟杆菌是肠道中的核心菌群之一，其丰度在肥胖或非酒精性脂肪肝等患者肠道内也相对降低。本文的研究团体在以往研究中发现，天然产物衍生物7d能够通过调节肠道菌群改善肥胖小鼠的代谢异常，其中吉氏副拟杆菌在喂食7d的肥胖小鼠肠道中丰度有所提高。为确认吉氏副拟杆菌是否介导以及如何改善宿主代谢，本文通过给肥胖小鼠喂食活的吉氏副拟杆菌LPD或其代谢产物来探究其具体机制。
论文ID
原名：Parabacteroides distasonis Alleviates Obesity and Metabolic Dysfunctions via Production of Succinate and Secondary Bile Acids
译名：肠道吉氏副拟杆菌通过产生琥珀酸和次级胆酸盐减轻宿主肥胖和代谢失常
期刊：Cell Reports
IF：8.032
发表时间：2019.1.2
通信作者：Hongwei Liu (刘宏伟), Shuang-Jiang Liu (刘双江)
通信作者单位：中国科学院微生物研究所
实验设计
为研究吉氏副拟杆菌能否与宿主相互作用并改善宿主代谢，将ob/ob基因突变的肥胖小鼠或高脂饮食诱导（HFD）的肥胖小鼠分为三组，分别每天灌胃给予PBS、活的吉氏副拟杆菌（LPD）或者巴氏灭菌的吉氏副拟杆菌（KPD），周期为4-5周。然后检测小鼠的肥胖症状、血脂及血糖相关指标。
为研究吉氏副拟杆菌的有益作用是否通过琥珀酸和次级胆酸盐，将ob/ob小鼠分为五组，第一组小鼠每天灌胃给予PBS，第二组小鼠的食物中添加琥珀酸，第三组小鼠每天灌胃给予乌索去氧胆酸和石胆酸混合物，第四组小鼠的食物中添加琥珀酸并每天灌胃给予乌索去氧胆酸和石胆酸混合物，第五组小鼠每天灌胃给予LPD，周期为4周。然后检测小鼠的肥胖症状、血脂及血糖相关指标。
实验内容
1. 吉氏副拟杆菌能够减轻肥胖小鼠的肥胖症状及代谢异常。
与喂食PBS的对照组ob/ob小鼠相比，LPD组ob/ob小鼠体重显著减少，进食量也降至75.6%，并且LEE指数有明显改善（图1A-C）。LPD组ob/ob小鼠血脂异常情况也有所改善，表现为血清中的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸和甘油三酯均有显著下降（图1D-F）。LPD组ob/ob小鼠白色脂肪组织中的脂肪细胞体积也有明显减小（图1G、1H）。另一方面，LPD组ob/ob小鼠体内糖化血红蛋白HbA1c、空腹血糖、进食后血糖和胰岛素水平均有所下降，同时对胰岛素敏感性上升（图1I-M）。而KPD组ob/ob小鼠在血脂和血糖水平，与对照组小鼠相比，均没有明显变化。虽然LPD组或KPD组ob/ob小鼠对葡萄糖不耐受的情况没有明显改变，但是相比对照组和KPD组，LPD组小鼠对胰岛素抵抗的情况有所改善（图1N-Q）。
图1 喂食LPD或KPD对ob/ob小鼠的肥胖症状及相关代谢的影响。
非酒精性脂肪肝通常与肥胖有关。研究者也发现，LPD组ob/ob小鼠的肝脏中，游离脂肪酸、甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平均有所下降（图2A-C）。通过HE染色和油红染色发现，LPD组小鼠肝细胞中大泡性脂肪变性和气球样变性的程度明显下降，肝内甘油三酯的水平也显著上升（图2D）。
图2 喂食LPD减轻了ob/ob小鼠的肝脂肪变性。
同样的，在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中观察到同样的现象。LPD组小鼠表现出体重减轻、进食减少、血脂异常得到改善，在葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗的方面也有明显的改善，同时，非酒精性脂肪肝的程度也有所下降。综上，喂食LPD能有效改善肥胖小鼠肥胖症状及相关的代谢异常。
2. LPD喂食增加了吉氏副拟杆菌的丰度
对ob/ob小鼠盲肠菌群的16S rRNA进行高能量测序，研究者发现喂食LPD的确增加了吉氏副拟杆菌的丰度，而喂食KPD则对吉氏副拟杆菌的丰度没有明显影响（图3A）。通过进一步的主成分分析（PCAs）和聚类分析，发现喂食LPD或KPD对小鼠肠道内其它微生物菌群没有显著影响（图3B、3C）。
图3 喂食LPD或KPD对ob/ob小鼠肠道菌群的影响。
3. 吉氏副拟杆菌影响胆汁酸代谢及FXR信号通路
吉氏副拟杆菌是如何影响宿主呢？有文献报导吉氏副拟杆菌对胆酸盐有很强的耐受，因此，研究者猜想吉氏副拟杆菌可能能够转变胆酸盐。首先通过体外实验，研究者们发现吉氏副拟杆菌的培养基中代谢产物包含6种胆汁酸及其衍生物（图4A）：胆酸、3-氧代脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、胆酸甲酯和脱氧胆酸甲酯。将吉氏副拟杆菌培养于富含初级胆酸盐牛磺酸鹅去氧胆酸的培养基中，通过液相色谱-质谱LC-MS，能够检测到培养基中有鹅去氧胆酸、7-氧-石胆酸和乌索去氧胆酸等产物的产生，表明吉氏副拟杆菌能够水解胆酸盐，将初级胆酸盐转变为次级胆酸盐。体内实验也证明了这一点。喂食LPD的ob/ob小鼠粪便中，结合胆酸盐甘氨脱氧胆酸含量明显下降，而游离胆汁酸胆酸、熊去氧胆酸和石胆酸的含量显著上升（图4B）。另外，在肝脏中，甘氨脱氧胆酸明显上升，而胆酸和脱氧胆酸则有所下降（图4C）。
一些次级胆汁酸是FXR受体的配体。通过结合肠道中的FXR受体，胆汁酸能诱导成纤维生长因子FGF的产生，进而下调肝脏中胆汁酸合成的限速酶--细胞色素P450酶Cyp7a1的表达。成纤维生长因子FGF抑制肝脏中的脂肪生成，促进脂肪酸的氧化，进而减轻饮食引起的肥胖。于是，研究者探究喂食LPD引起的胆酸盐水平的改变是否参与调节肠道FXR信号通路。结果发现，相比对照组，LPD组ob/ob小鼠，血清和回肠中FGF15的表达有所上升（图4D、4E），说明可能激活FXR信号通路，同时，肝脏中Cyp7a1的水平有所下降（图4F）。而胆汁酸调控的另一条对葡萄糖代谢和体重调控有益的信号通路TGR5-GLP-1信号通路则没有影响（图4G、4H）。肠道中乌索脱氧胆酸的产生和FXR信号通路的激活能够增强肠道屏障相关基因的表达。研究者检测到，喂食LPD后，ob/ob小鼠血浆中双胺氧化酶活性有所降低，血清中脂多糖LPS浓度也有所下降，而紧密连接相关蛋白Claudin-1、ZO-1等表达上升（图4I-4L）。高脂饮食诱导的肥胖小鼠喂食LPD后，也表现出FXR信号通路激活，肠道屏障功能得到提高。
图4 吉氏副拟杆菌影响胆酸盐代谢及相关信号通路
4. 吉氏副拟杆菌促进琥珀酸引起的糖异生
肠道中微生物酵解糖类产生的短链脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，不仅能够作为肠上皮细胞的能量来源，它们还能结合相应受体参与信号转导，调节上皮细胞的代谢平衡。副杆状菌属主要产生乙酸和琥珀酸。研究者们检测到吉氏副拟杆菌培养基中有高浓度的琥珀酸产生。研究者用气相色谱-质谱GC-MS检测LPD组ob/ob小鼠中，短链脂肪酸和琥珀酸的浓度。他们发现，与对照组相比，LPD组ob/ob小鼠的中段小肠中琥珀酸的浓度显著上升（图5A），而乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的浓度则没有明显变化（图5B）。
研究者也发现，LPD组ob/ob小鼠中段小肠中葡萄糖的浓度有所上升（图5C），暗示糖异生过程的增强。有文献报导，肠道中琥珀酸激活糖异生能够抑制肝脏中葡萄糖-6-磷酸酶将6-磷酸葡萄糖转化为葡萄糖，调节肝脏中的葡萄糖代谢平衡。研究者们也观察到LPD喂食的ob/ob小鼠肝脏中葡萄糖-6-磷酸酶有34.3%的下降，6-磷酸葡萄糖浓度也有显著增加（图5D、5E）。高脂饮食诱导的肥胖小鼠喂食LPD后，也能观察到糖异生的激活。以上实验表明，吉氏副拟杆菌可能通过增加肠道中琥珀酸的浓度来激活糖异生的过程，从而改善宿主的高血糖。
作为三羧酸循环重要的中间产物，琥珀酸也是糖异生中葡萄糖产生的前体。为进一步阐明琥珀酸在糖异生中的作用，研究者们检测了喂食LPD的小鼠小肠中糖异生途径中各产物的浓度。果糖-1，6-二磷酸有33.2%的下降，而6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖及葡萄糖分别有79%、69%和121%的上升（图5F）。催化果糖-1，6-二磷酸生成6-磷酸果糖的果糖-1,6-二磷酸酶活性则增加了1.6倍（图5G），虽然其表达没有发生改变（图5H），说明琥珀酸可能促进果糖-1,6-二磷酸酶的活性。体外实验也证明了这一点，琥珀酸能够浓度依赖地激活小鼠小肠中纯化得到的果糖-1,6-二磷酸酶和人重组肝果糖-1,6-二磷酸酶（图5I）。通过等温滴定量热实验ITC，检测到琥珀酸与果糖-1,6-二磷酸酶特异性的结合（图5J）。因此，可以推论琥珀酸是肠道中果糖-1,6-二磷酸酶的天然激动剂。
图5 吉氏副拟杆菌促进琥珀酸的产生，激活糖异生途径
为弄清小肠中琥珀酸与肠道中吉氏副拟杆菌的关系，研究者检测了野生型C57BL/6J小鼠、高脂饮食小鼠和ob/ob小鼠肠道中琥珀酸的浓度与吉氏副拟杆菌的丰度。结果发现，野生型C57BL/6J小鼠小肠各段中吉氏副拟杆菌的丰度和琥珀酸的浓度均高于高脂饮食小鼠和ob/ob小鼠。而喂食LPD后，高脂饮食小鼠和ob/ob小鼠其空肠中吉氏副拟杆菌的丰度和琥珀酸的浓度均有所上升。因此，可以推测琥珀酸与吉氏副拟杆菌密切相关。
5. 琥珀酸和次级胆酸盐可以模拟吉氏副拟杆菌产生的有益影响
为进一步证明吉氏副拟杆菌产生的琥珀酸和次级胆酸盐的作用，研究者们在ob/ob小鼠食物中添加了琥珀酸，或者喂以次级胆酸盐乌索去氧胆酸和石胆酸混合物。结果表明，喂食琥珀酸的ob/ob小鼠体重减轻，进食也有所减少，血浆中HbA1c和胰岛素水平降低，对胰岛素的敏感性增加（图6A-6E）。喂以次级胆酸盐的ob/ob小鼠，其血糖水平没有明显改善，但血脂浓度和肝性脂肪变性得到改善。而同时得到琥珀酸和次级胆酸盐喂食的ob/ob小鼠，其血糖水平、血脂浓度和肝性脂肪变性方面均有显著的改善（图6C-6I）。与喂食LPD的小鼠相似，喂以次级胆酸盐和同时喂以琥珀酸/次级胆酸盐的小鼠，肠道中FXR信号通路被激活，维护肠道屏障完整性的蛋白表达上升（图6J-6N）。而喂以琥珀酸和同时喂以琥珀酸/次级胆酸盐的小鼠，糖异生激活以及糖异生过程中的果糖-1,6-二磷酸酶的活性有显著上升（图6O、6P）。
图6 喂食琥珀酸和次级胆酸盐混合物对肥胖小鼠的影响
结 论
该研究发现吉氏副拟杆菌能够调节宿主代谢，减轻ob/ob小鼠和高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体重，改善其高血糖和肝性脂肪变性等。给小鼠喂食活的吉氏副拟杆菌能够改变宿主肠道内胆酸盐的组成，提高石胆酸和乌索去氧胆酸的含量，也能提高肠道内琥珀酸的水平。体外实验也证明吉氏副拟杆菌具有转化胆酸盐和产生琥珀酸的能力。食物中补充琥珀酸能够通过激活糖异生改善肥胖小鼠的高血糖。而喂以石胆酸和乌索去氧胆酸的混合物可以通过激活FXR信号通过、维护肠道屏障完整性改善高血脂。同以给予琥珀酸和次级胆酸盐混合物能够模拟喂以活的吉氏副拟杆菌的益处。同时研究也发现，糖异生过程的限速酶果糖-1,6-二磷酸酶是琥珀酸的结合靶点。综上，该研究发现，吉氏副拟杆菌产生的琥珀酸和次级胆酸盐对宿主代谢的调节起着重要的作用。
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