科研 | Nature：独特的代谢利基让肠道菌群定植成为可能（IF: 41.577）
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肠道中高密度的微生物生态系统与人类生物学密切相关，微生物群的活动对人类健康有着深远的影响。在没有深度扰动的情况下，个体内的细菌菌株能够长时间保持稳定；相比之下，应用于已建立菌群的外源性共生体和益生菌的命运则具有多变性，且极易受到背景微生物的影响。因此，分析影响控制菌株的定植和丰度的因素对微生物群落重组的新兴领域具有重要意义。
论文ID
原名：An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota
译名：独特的代谢利基让肠道菌群定植成为可能
期刊：Nature
IF：41.577
发表时间：2018年
通信作者： Justin L. Sonnenburg
通信作者单位：Department of Microbiology and Immunology, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA
实验设计
实验材料：正常小鼠，无菌小鼠（GF）
实验处理：向包含小鼠(受限菌群(RF))和人类(hum-1, hum-2)三种不同肠道菌群的小鼠植入NB001（一种罕见的肠道共生菌）。对粪便中的NB001进行为期7天的跟踪，并向其投喂含有菊糖(in.)或富含紫菜聚糖(por.)的多聚糖食物。
实验流程图
实验内容
1. 不同菌落整合NB001的能力比较
为探究入侵的多变外源性细菌以不同的菌群对宿主的变异影响程度，实验选取一组具有常规小鼠菌群的小鼠和两组无菌小鼠。三组小鼠均接受了一种罕见的肠道共生菌(NB001)菌株，因为它能够同时利用食物中的果糖和海洋多糖。在7天的时间里，采用绿色荧光蛋白(GFP)-阳性菌落形成单元(c.f.u) 选择性培养法对NB001进行跟踪(图1a)。结果显示，不同的菌落（扩展数据图1）整合NB001的能力不同(图1b)，而且其中一种菌群被完全排斥定植。
图1 添加特殊的营养物质可调节生态位的有效性
扩展数据图1 三种模式背景的肠道微生物群落彼此各不相同
2. 不同小鼠食物中添加菊糖前后粪便中NB001的密度比较
考虑到肠道内资源的竞争，我们假设特定的MACs可以使定植在不同群落中进行调整。在此之前，我们将这种策略应用于两种Bacteroides寄生的无菌小鼠身上，通过增加食物中的菊糖使偏好菊糖的菌株得以增殖。为了测试这种方法在复杂菌群环境下的适用性，我们在接种NB001的7天后给上述三组小鼠注射了菊糖作为唯一的碳源，使其快速生长(扩展数据图2a)。在给这三组小鼠喂食与先前研究相同的以菊粉为基础的饮食七天之后，NB001在不同背景的微生物群中表现出不同的反应(图1 c)。
NB001的全基因组测序显示出一个与先前描述的紫菜聚糖PUL高度同源的基因簇（扩展数据图2b），敲除紫菜聚糖利用基因验证了完整的PUL在体外对紫菜聚糖特异性生长的需求（扩展数据图2c）。在接种NB001的7天后，向三组小鼠投喂富含紫菜聚糖的海藻（10% nori w/w）。结果发现，无论背景微生物群情况如何，添加海藻后NB001密度都出现了显著增长，不同的群落中定植水平的变异性被消除（图1d）。在食物中获得紫菜聚糖后，菌群排斥性最强的小鼠NB001密度大幅提升，达到与其他两种菌群小鼠相近的水平（图1d）。这些数据表明，尽管这一特定多糖体系在群体中存在着潜在的局限性，利用稀有营养素及其同源利用系统来控制不受背景微生物群影响的菌株定植依然是一种有效的方法，养分可利用性是影响菌株整合到肠道菌落的关键因素。
扩展数据图2 NB001可以同时利用菊粉和紫菜聚糖作为生长的唯一碳源
3. 添加和去除底物是否可以逆转地扩张种群大小
使用NB001对含有常规菌群的小鼠进行定植，在粪便中追踪c.f.u。在之后的5天里向其饮水内添加1%的紫菜聚糖。为验证饮食中竞争多糖的影响，分别设置标准MAC量、富含MAC以及缺乏MAC三个条件进行实验，不提供其他外源多糖。结果显示，不管是否存在MAC竞争，紫菜聚糖的引入后NB001丰度明显提高（图2a, b）。这一响应在敲除8个紫菜聚糖代谢所需基因后响应消失（图2c）。此外，紫菜聚糖单独存在时对背景菌群的组成没有显著影响（扩展数据图3），证明背景微生物群并未利用紫菜聚糖。
在缺乏紫菜聚糖的情况下PUL+菌株被PUL-菌株排斥（图2d）；在饮水中补充只对PUL+菌株有效的紫菜聚糖后，PUL+菌株克服了生态文学的优先效应，并导致PUL-菌株被取代（图2e），这一反应需要在PUL+菌株接触到紫菜聚糖后才能实现（扩展数据图4）。中间的定植化状态可以通过短时间的紫菜聚糖调控来实现（图2f）。
图2 特定的的营养物质可以调节种群大小并克服同基因的自我排斥
扩展数据图3 紫菜聚糖单独存在的情况下对肠道菌群的影响不显著
扩展数据图4 是否接触紫菜聚糖是决定定植体取代情况的主要因素
4. 不同长度PULs整合到目标菌株后菌株生长情况
将NB001紫菜聚糖PUL序列与以前发表的B. plebeius杆菌PUL进行比对（图3a）。构建三种不同的最小限度PULs，从全长PUL的10个基因到34个基因（20-60kb）。通过酵母的同源重组在酵母中组装质粒，将其整合到两个不能利用紫菜聚糖促进生长的目标菌株（Bacteroides stercoris和Bacteroides thetaiotaomicron）的染色体上（扩展数据图5）。结果发现，10基因PUL的导入不足以将紫菜聚糖的生长传递给被检测的Bacteroides原始种，而21基因PUL和34基因PUL都能在体外促进菌株的生长(图3b)。值得注意的是，含有21基因PUL的两个物种在生长过程中均达到了各自不同的最大吸光度（扩展数据图6）。34基因PUL的结合效率显著下降，只有B. stercoris产生了转移接合子。当定植到具有常规菌群的小鼠体内时，含有21基因PUL的B. taiotaomicron的丰度可以通过在水中添加紫菜聚糖进行可逆性扩增(图3c)，这也发生在34基因PUL的B. stercoris定植小鼠上(扩展数据图7)。
图3 控制群体规模可以被设计且高度可调
扩展数据图5 通过PCR反应和酵母组装构建微紫菜聚糖利用PULs
扩展数据图6 B. stercoris和B. thetaiotaomicron在基本培养基中生长能力不同
扩展数据图7 携带34基因PUL的B. stercoris的丰度可以在常规小鼠微生物群条件下得到控制
5. 通过改变饮食中紫菜聚糖的添加量来调节菌株的丰度的可行性
对含有GFP荧光NB001菌株常规菌群的小鼠进行定植，在其饮用水中添加1%、0.1%以及0.01% w/v紫菜聚糖并追踪粪便中c.f.u。结果发现，水中紫菜聚糖每稀释10倍，粪便中NB001的丰度就会降低10倍(图3d)，这表明通过调节紫菜聚糖浓度可以很好地控制菌株丰度。通过共焦显微镜观察0.01%和1% w/v两组小鼠的近端结肠的冷冻组织切片，与1%组相比，接受0.01%紫菜聚糖的小鼠的GFP-阳性细胞显著增加(图3e)。
6. 紫菜聚糖的摄入能否促进结肠隐窝的定植
采用表达红色荧光蛋白(RFP)的野生型B. thetaiotaomicron对无菌小鼠进行了定植，并在7天后用含有21基因紫菜聚糖PUL并表达GFP的B. thetaiotaomicron对其进行激活。当小鼠在饮食中没有摄入紫菜聚糖时，GFP表达菌株受到排斥(图4a, c)；然而，当小鼠接受富含紫菜聚糖的海藻食饵后，表达GFP的紫菜聚糖偏好型菌株能够在结肠隐窝中定植(图4b, c)，这表明特定的营养利用方案可以使这种特殊的微生境发生重构。
图4 紫菜聚糖促进结肠隐窝的定植
实验结论
这篇论文探究了外源性菌株在特定的营养获取情况下在肠道菌群中定植的情况，以期找到一类针对性的营养支持，使菌株替代成为可能。通过将紫菜聚糖转移到一种原始拟杆菌菌株中，并通过不同用量对小鼠肠道中菌株丰度进行了精细的调节控制。最终证实该系统能够在结肠隐窝生态系统中引入新的菌株。这些数据突出了营养可得性对形成菌群的影响，扩大了在复杂菌群背景下进行广泛研究的能力，并对肠道内基于细胞的治疗策略有重要意义。
点评
本文阐明了作为菌种定植和丰度控制的重要原则——专一性营养获取的概念。此外，实验方法的研究背景独立性、可逆性和可调性将这些结果的效用扩展到广泛的应用中。了解营养在微生物群落中的作用，可以清晰地勾勒出我们对肠道生态位景观的印象，有助于增进对人体健康体系的深入了解。