科研 | 一个简单，方便，廉价的粪便取样方法
本文由董小橙编译，董小橙、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
方便，可重复和快速保存独特的生物标本是其在微生物组分析中的关键。随着越来越多的人体研究将肠道微生物组纳入其设计中，对于简化的样品采集和储存方法有很高的需求，这些方法可以满足不同的设置和实验需求。虽然一些商业试剂盒解决了基于序列的研究的收集/运输需求，但这些方法不能为需要可行微生物的研究正确保存样品。本研究描述了用于储存和二次取样的粪便样品处理的粪便等分吸管技术（FAST）。FAST允许重复的二次取样而不需要解冻样品，并且需要最少的供应和存储空间，使得在实验室和现场使用都很方便。FAST具有通过简单，可重复的样品处理推进微生物组研究的潜力。
原名：Fecal Aliquot Straw Technique (FAST) allows for easy and reproducible subsampling: assessing interpersonal variation in trimethylamine-N-oxide (TMAO) accumulation
译名：粪便等分吸管技术（FAST）允许简单和可重复的二次取样：评估氧化三甲胺积累的人际差异
期刊：Microbiome
IF：9.133
发表时间：2018年
通信作者：Federico E. Rey
通信作者单位：美国威斯康星大学麦迪逊分校细菌学系
实验设计图
1 粪便等分吸管技术（FAST）
FAST的具体操作是：将粪便直接排便到无菌容器中，然后将样品在4°C下储存和运输，在收集后48小时内送到实验室，没有冻结迹象。经紫外线处理并修整过的取样铲（即修整成吸管，原文使用的耗材为VWR 80081-190）在粪便中反复插入，直到用均匀的混合物和最小的气穴填充吸管。该过程需要在生物安全柜中进行。如果有足够的粪便材料，则对每个样品处理四根吸管。在粪便样品太软或太水而无法填充吸管的情况下，使用无菌1ml注射器。将填充的吸管（或注射器）在干冰上冷冻，插入15ml锥形管（一个锥形管可放2根吸管）中，并储存在-80℃直至后来使用（图1）。在样品之间，操作员使用Trifectant和更换手套对工作空间进行净化。
图1 粪便等分吸管技术
2 FAST可以对冷冻粪便进行一致和方便的二次取样
将FAST处理的样品从冰箱中取出并通过用无菌剃刀刀片切割1cm切片进行二次取样，同时将吸管保持在干冰顶部以防止解冻。对每个受试者取两个随机选择的吸管，从这里称为“S1”和“S2”。S1仅用于DNA提取，而S2用于制备用于定殖无菌（GF）小鼠的口服管饲法。结果共获得了250万个高质量序列（每个样品62,600±62,700），所有样本的Good’s覆盖率> 98％。将用于α和β多样性分析的变化数据集标准化为每个样品4500个序列。
从不同吸管收集的FAST样品具有高度可重复性。尽管在DNA提取之前样品处理存在微小差异，但通过香浓多样性指数及未加权UniFrac距离评估发现受试者（即S1和S2）的多样性和总体微生物群落没有差别（图2a）。对于每个受试者，两个等分试样中至少有一个可检测到几乎为100％的超过0.1％丰度的细菌门（图2b）。对于所有受试者，在S1中检测到的细菌门和细菌目可以在S2中100%检测到。在科水平（98.8±0.8％），属水平（99.1±0.6％）和OTU水平的分类群（99.8±0.2％;图2b）中也观察到两个等分试样之间的高度一致性。在两个等分试样之间未连续恢复的OTU代表低丰度的分类群（0.1-0.3％）。在所有样品中，S2中回收的OTU占S1群落的大部分，在S1样品中相对丰度的总和大于98％（图2c）。
图2 FAST二次取样捕获的可再生的菌群
3 使用FAST处理的样品接种无菌小鼠
将来自每个人样品的S2用作口服接种物，以定殖八组不同的无菌（GF）小鼠（3只动物/组）。在收集粪便样品之前，将定殖的动物饲养2周。将菌群移植的小鼠粪便样品进行16S rRNA基因分析，结果表明根据受试者的不同小鼠进行不同的聚类（图3a）。在每个受试者的四个样品中至少有一个（即S2和三个小鼠粪粒）中，大于0.1％相对丰度的细菌门的回收率为100％（图3b）。在定植2周后，在小鼠粪便中检测到供体的97.4±1.7％的细菌目，91.8±2.1％的细菌科和87.7±1.4％的细菌属（图3b）。虽然FAST移植捕获了大部分人类微生物群，但在口服管饲（S2）中检测到的丰富的OTU并没有在小鼠中完全成功恢复（图3b，c）。2周后在小鼠中恢复的OTU平均为口服接种物中存在的OTU的78.5±2.2％（图3b），存在的菌群群落的78.5±2.1％（图3d）。此外，移植小鼠的细菌群落与其供体相比，比其他任何人的样本更相似（图3e）。
图3 移植的菌群捕捉人类菌群的多样性和特性
4 方法应用：评估微生物胆碱代谢的个体间差异
氧化三甲胺（TMAO）的累积提供了微生物代谢活动的间接测量，其能够评估移植后的功能恢复。研究结果表明，移植肠道菌群的胆碱代谢能力是不同的（图4a），表明人际差异很大。此外，本研究显示TMAO水平与胆碱生物利用度相关（图4b，c）。
图4 TMAO丰度与胆碱生物利用度呈负相关
本研究主要介绍了粪便等分吸管技术，其提供了一种简单，廉价，可重复的工作流程，用于处理和储存可在偏远地区完成的粪便样本（人或其他动物）。它减少了运输的样品量，并能够从有价值的样品中重复进行二次取样（吸管碎片）。FAST最大限度地降低了与之前采样方法相关的风险，包括重复的冻融循环，为未来的采集工作提供了新的解决方案。
粪便等分吸管技术，操作简单方便，无需反复冻融，确实有很大的优点。但这个过程要保持无菌操作并且要避免样品融化，也许在进行这个方法之前在粪便中加入保护液，效果可能会更完美一些。评价仅是小编的个人看法，欢迎大家一起进行讨论。另外，有需要粪便保护液的朋友也可以联系我们。如果有什么问题也欢迎大家一起讨论。