科研|当代谢组学与纳米材料相结合，会有怎样的火花？（国人作品）
本文由George编译，董小橙、江舜尧编辑。
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纳米材料（Nanomaterials）由于其自身优异的机械、电子、光学、生理化学及物理化学性能，被广泛应用于很多领域。在超过2000种纳米材料制成的产品中，25%的产品含有银，纳米银（nAg）被用于杀菌目的（医疗器械、食品储存、化妆品等）已超过1个世纪。然而，纳米材料高比表面积和生理化学活性会导致健康风险、副作用，已引起人们高度的重视。为了降低纳米材料的纳米毒性，人们采用表面改造，尺寸、形状调节等方法来进行优化，不过相应的措施却导致纳米材料生物兼容性、功能受到不利影响。本文针对nAg，试图用代谢组学的方法找到nAg所下调的细胞代谢产物，并作为nAg“涂层”，从而改善了生物兼容性和nAg的功能。
原名：Screening Small Metabolites from Cell as Multifunctional Coatings Simultaneously Improves Nanomaterial Biocompatibility and Functionality
译名：从细胞中筛选代谢物作为纳米材料多功能涂层并改善其生物兼容性和功能性
期刊：Advanced Science
IF：12.441
发表时间：2018年
通信作者：胡献刚
通信作者单位：南开大学
1 筛选合适的代谢产物用以控制纳米毒性
研究人员采用多角球形的nAg作为研究材料，尺寸范围20至160nm，其中大多数纳米分子大小为60-80nm。根据前期实验的结果，100mg L-1nAg能显著降低细胞活性，因此在本实验中，选取该浓度的nAg对细胞进行处理，并以代谢组学的技术分析其中的代谢产物变化。
图1通过GC-MS所检测到的代谢产物Heatmap图
经过Volcano plots, PLS-DA和微阵列显著性分析（SAM），最终确定6个代谢产物进行后续分析，包括L-天冬氨酸、L-苹果酸、肌醇、D-山梨醇、柠檬酸和L-半胱氨酸。
图2 nAg作用下细胞中差异表达的代谢产物
除了L-半胱氨酸的另外5个化合物在nAg作用下表现为下调。对于L-半胱氨酸，之前的报道该物质可以通过络合释放的Ag+减少nAg纳米毒性。
通过向实验组补充下调的代谢物也可能恢复nAg导致的失衡。为了防止细胞过量吸收多余的代谢物导致代谢功能紊乱，接下来的实验首先测定下调的5个代谢物的浓度，再进行代谢物添加实验。
2 代谢物减轻nAg细胞毒性
流式细胞结果中的散射（SSC）强度与颗粒吸收呈正相关。用nAg处理过后，样品的SSC强度增加。同时，实验结果显示添加的代谢物并不直接影响nAg吸收，但是显著减轻了nAg对细胞活力抑制的影响，尤其是D-山梨醇和肌醇。
图3细胞对nAg的吸收和细胞活性分析
多余的活性氧族（ROS）会导致线粒体功能紊乱，从而又会引起ROS形成和细胞凋亡。在添加了四种代谢物后，nAg引起的ROS上升得到了抑制，尤其是D-山梨醇和肌醇效果最为明显。对于细胞凋亡测试也表明，D-山梨醇对nAg诱导的凋亡具有防护作用，且D-山梨醇平衡了“程控”凋亡，抑制了细胞从早期凋亡向晚期凋亡的转变。
图4 细胞中的ROS分析和细胞凋亡分析
对细胞形态分析显示，nAg能减少正常尺寸的细胞数量，增加非正常尺寸的细胞。而采用D-山梨醇进行处理后，正常尺寸细胞占比（72.9%-78.6%）高于nAg处理的样本中正常细胞占比（69%）。
图5 e中绿箭头表示正常细胞，红箭头指示非正常细胞；f代谢物处理后改变了细胞尺寸
因此，D-山梨醇比其余代谢物更明显的减轻nAg导致的细胞毒性，防护效果更好。
3 nAg/D-山梨醇复合物稳定性极高
nAg的转化和凝聚决定了其形态和生物利用率。添加的代谢产物（柠檬酸，L-苹果酸和L-天冬氨酸）显著将nAg的流体力学直径从约100nm增加到200nm，从0至12h持续增长。D-山梨醇也能增加nAg流体力学直径，但是轻微的增长不随时间而增强，肌醇不增加nAg流体力学直径。纳米微粒直径的增加是由于表面涂层的形成，因此在低浓度条件下，D-山梨醇比肌醇对nAg的包裹效果更好。
进一步对电动电势进行探讨，D-山梨醇、肌醇的添加，使nAg电动电势低于-35Mv，表明这两个物质增强了nAg的稳定性。同时，也有实验数据显示相较于肌醇，更多的D-山梨醇吸附到了nAg纳米颗粒上。
对离子释放情况分析显示，仅有D-山梨醇减少了nAg中离子的释放，从139.24±4.99降低至96.63±7.61ug L-1 。
图6 裸露的nAg和nAg/代谢物复合物物理性能对比分析
4 D-山梨醇通过表面钝化作用抑制细胞内nAg释放Ag+
为了确认D-山梨醇对细胞内nAg释放Ag+的抑制效果，研究人员分别测定了胞内的nAg和Ag+含量。测定结果显示，添加了D-山梨醇后，nAg对Ag+比值从0.03增加到0.29。由此，D-山梨醇抑制了Ag+释放。
X射线光电子光谱确定了nAg/D-山梨醇复合物表面是钝化的，因此可以看出nAg能钝化nAg表面，防止其被氧化。
在采用AgNO3释放Ag+作为阴性对照的模型中，Ag+对细胞活性的降低和对ROS水平的升高没有受到D-山梨醇的抑制。由此，D-山梨醇对nAg诱导的细胞毒性的抑制作用，依赖于其对AgNPs表面的钝化处理，而不是直接影响Ag+。
5 包裹D-山梨醇能增强nAg分散度，维持自然形态
由于半胱氨酸能抑制Ag+转化为Ag0，因此采用包裹半胱氨酸的nAg作为阳性对照。nAg-山梨醇比裸露的nAg或者nAg-半胱氨酸均具有更高的分散性。nAg-山梨醇的尺寸随着PH值的增加略微降低，直径在酸性环境中会比在中性、碱性环境下稍大，表明H+结合到D-山梨醇的氢氧根上。在中性环境中，nAg-山梨醇电动电势比nAg更低，表明负电荷增加，即来自于D-山梨醇中的氢氧根作为“涂层”。种种实验结果表明，不同于已知的L-半胱氨酸修饰，D-山梨醇能增强nAg分散性，维持其自然形态。
图7 nAg、nAg-山梨醇、nAg-半胱氨酸特征比较
6 包裹D-山梨醇降低nAg纳米毒性
用nAg，nAg-山梨醇，nAg-半胱氨酸处理细胞后，细胞活性分别低于60%，高于75%和高于80%。与对照组相比，nAg，nAg-山梨醇，nAg-半胱氨酸生成的ROS水平，“上升”分别超过150%，低于140%，低于130%。nAg表面的负电荷能够抑制nAg氧化，络合释放的Ag+。与裸露的nAg相比，nAg-山梨醇和nAg-半胱氨酸释放的Ag+都更少，而抑制Ag+的释放能减轻纳米毒性。同时，功能基团对nAg的覆盖能隔绝空气中的氧气。
图8 nAg中释放的Ag+浓度
7 D-山梨醇覆盖的nAg具有高度且持久的抗菌活性
nAg抗菌效果很大程度上依赖于Ag+释放。L-半胱氨酸覆盖的nAg虽然减少了纳米毒性，但是具有较低的抗菌活性。因此，研究人员将重点放到了D-山梨醇覆盖的nAg上。测试实验显示，在AgNO3（100 mg L-1）作用下，对细菌增殖的抑制能持续6-9h，不管是E. coli，还是S. aureus，都没有明显的OD值增加。同样，采用200mg L-1 nAg和200mg L-1nAg-山梨醇处理E. coli时，能得到与AgNO3类似的杀菌效果。此外，相较于裸露的nAg，9h后nAg-山梨醇对S. aureus有更高的抗菌活性。从而，nAg-山梨醇具有持续抗菌效果。
通过进一步的实验证明，nAg-山梨醇复合物的抗菌能力，要高于分别添加nAg和D-山梨醇进行处理的实验设计。综上，nAg-山梨醇展现了更高的生物兼容性和更持久的抗菌活性。
图9 Ag+和基于nAg的纳米颗粒抗菌能力比较
本文通过代谢组学方法，从细胞中筛选代谢物作为纳米材料的“涂层”，能够改善纳米材料的生物兼容性和功能性。采用nAg处理细胞，筛选得到D-山梨醇作为“涂层”，覆盖nAg组成的复合物，显著的降低了nAg的细胞毒性，并且具有持久的抗菌活性。