大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养方法

1、培养板的包被

（1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，洗洁精浸洗、烘干。

（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

（3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2、大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养

(1) 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的健康SD大鼠，在无菌条件下断头，分离并切取脊髓，置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

(2) 无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3) 用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 10min，期间振摇 2~3 次。

（4）巴斯德吸管轻轻吹打 20次，静置 5min，将细胞上清移入新的无菌离心管，加入完全接种液终止消化。剩余组织按照上述步骤继续消化，重复2-3次，制成细胞悬液。

（5）将新的离心管中细胞悬液，离心（1000r/min，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。

（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以 400µl/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24 孔培养板

（7）置 37℃、5%CO2培养箱培养 4～6h，全量更换为无血清培养液。

（8）体外培养第 3天，加入Ara-C 工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。

(9) 此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21天的细胞用于实验。