国人高分综述 | Molecular Cancer：肝细胞癌中长非编码RNA的机制与作用
编译：思越，编辑：十九、江舜尧。
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肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的亚型，也是世界范围内肿瘤相关死亡的主要原因之一。然而，肝癌发病的分子机制尚未完全了解。最近有新的证据表明长非编码RNA（LncRNA）在肝癌的发生发展中起着关键作用。本文就LncRNA在肝癌中的表达及其在肝癌发生中的抑癌作用作一综述，并探讨了其在肝癌中的诊断和治疗潜力。
论文ID
原名：The role of long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.
译名：肝细胞癌中长非编码RNA的作用
期刊：Molecular Cancer
IF：10.679
发表时间：2020年4月15日
通讯作者：黄灿华
通讯作者单位：四川大学华西基础医学与法医学院
DOI号：10.1186/s12943-020-01188-4
主要内容
1.LncRNA作为肝脏微环境和慢性肝病的调节剂
肝癌具有病毒感染，再生信号和低氧微环境等特性，这些特性为HCC细胞的增殖和存活提供了机遇和挑战。LncRNA调节免疫反应，肝脏再生和氧化还原信号。在这些过程中，LncRNA的失调会导致慢性肝炎，肝脏过度生长和氧化应激反应，最终导致HCC的发生（图1）。
（1）病毒感染
乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是两种主要引起慢性肝脏炎症的病毒，未经及时治疗会发展为HCC。肝炎病毒通过多种机制促进自身复制，其中之一是调节LncRNA的转录。HBV X蛋白（HBx）上调癌基因LncRNA-HUR1，阻断p53以促进HCC生长，并下调抑癌LncRNA-Dreh，导致波形蛋白的重新表达，促进肝癌转移。在病毒感染过程中，宿主免疫通常被激活。然而，肝炎病毒可以改变Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号，导致免疫反应缺陷。研究表明，HCV感染可上调IFI6、CMPK2和EGOT等LncRNA的水平，抑制IFN刺激基因（ISG）的表达，从而导致免疫抑制和慢性炎症。
（2）肝再生
肝是部分切除或化学损伤后唯一再生的内脏器官。肝切除术后，由于尿激酶活性升高，肝生长因子（HGF）被释放，从而激活EGFR和c-Met，使Wnt等多种信号增强以促进肝细胞增殖。增殖完成后，TGF-β抑制尿激酶和HGF的功能，从而使肝细胞回到静止状态。研究发现，LncRNA-LALR1、lncHand2等LncRNA参与该过程。一旦LncRNA失调，会诱导持续性的增殖信号转导，常导致HCC的发生。这些LncRNA可能在没有肝组织丢失的情况下被激活，或者不能被静止信号TGF-β沉默。
（3）氧化应激
肝脏约占体重的2%，却接受约25%的心输出量。充足的血液供应对其氧需求是必不可少的，而供氧不足或抗氧化机制不足往往导致缺氧性肝损伤。饮酒、病毒感染、药物解毒、代谢等多种危险因素会诱导活性氧（ROS）的积累，导致肝脏氧化应激。在缺氧位环境下，肝癌细胞通常促进血管生成，从而从血流中获得额外的氧气供应。HIF-1α被证明参与促血管生成过程。此外，研究发现，部分LncRNA对缺氧敏感（如linc-RoR），在缺氧应激下上调HIF-1α以支持肝癌细胞存活。相反， LncRNA LET等负调控HIF-1α的LncRNA，在HCC进展中下调。可能因为LncRNA LET使RNA结合蛋白NF90降解，导致HIF-1αmRNA失调。
2.肝癌组织中LncRNA的异常表达
表观遗传修饰、转录复合物招募和RNA加工是调节LncRNA生物发生的主要过程。LncRNA基因的表观遗传修饰可能遵循与蛋白质编码基因几乎相同的调控规律。在转录之前，LncRNA启动子内通常包含激活染色质的标志，如H3K9和H3K27的乙酰化，H3K4的二甲基化或三甲基化。RNA聚合酶II被招募来启动LncRNA的转录，通常，LncRNA基因倾向于与相邻蛋白质编码基因共享同一启动子，通过5′端的甲基鸟苷帽、3′端的聚腺苷酸a尾和剪接内含子等经典途径被加工为成熟LncRNA。部分LncRNA还可通过非经典途径，如LncRNA MALAT1和MENβ被RNase P和RNase Z切割后，3′端形成三螺旋结构，在没有poly（A）尾的情况下保护LncRNA 不被降解。
LncRNA的异常表达被证明与包括HCC在内的多种疾病发病机制有关。高通量测序显示，与非癌性肝组织相比，HCC组织中LncRNA的表达谱明显不同（表1），这些异常表达通常与抑制/促进LncRNA的表观遗传沉默/激活、促癌/抑癌转录因子对LncRNA的转录激活/抑制、使LncRNA具有致癌功能的特殊加工模式以及LncRNA与microRNA或蛋白结合从而影响LncRNA稳定性有关（图2）
表1 部分失调LncRNA在肝癌发生发展中的作用
（1）表观遗传修饰
在HCC进展过程中，LncRNA基因的DNA甲基化和组蛋白修饰，使HCC抑制性LncRNA表达减少（图2a）或HCC促进性LncRNA表达增加（图2b）。研究发现，DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3诱导抑癌基因LncRNA-MEG3的启动子高甲基化，其表观遗传沉默导致肝癌细胞凋亡抵抗和肝癌生长。由于H3K27乙酰化作用增强使得linc00441过度表达，linc00441又使DNMT3A发生甲基化并使其邻近基因RB1失活，从而促进肝癌细胞的增殖
（2）转录激活
已经证实，YAP、c-Myc和β-catenin等致癌转录因子在肝癌组织中过度表达，并启动如LncRNA等非编码基因的转录。在肝癌中检测到增强的Myc信号，可能与被Myc调节的LncRNA（如linc00176）有关，进而导致肝癌细胞周期停滞和坏死。（图2c）
（3）RNA加工
LncRNA转录本经过特殊处理，例如选择性剪接（图2d）等方式为肝癌的发生发展提供致癌作用。剪接因子MBNL3在胎儿肝脏和肝癌组织中高表达，被证明可诱导外显子4包含LncRNA PXN-AS1，使得LncRNA PXN-AS1与PXN mRNA相互作用并防止其降解，从而导致肝癌发展。
（4）其他
LncRNA可作为竞争性内源性RNA（ceRNA）与miRNA结合，行使miRNA海绵的作用，影响miRNA靶基因的表达，而miRNA也会影响LncRNA的表达（图2e）。miR-34a直接结合LncRNA-UFC1以降低其半衰期，从而抑制LncRNA-UFC1诱导的肝癌细胞增殖。部分蛋白质（如RNA结合蛋白RBPs）还可以结合LncRNA来调节代谢，并通过物理相互作用调节LncRNA的稳定性。
3.肝癌中LncRNA的功能机制
LncRNA可以通过与DNA结合、RNA相互作用、与蛋白质结合、产生小肽等途径发挥调节作用。与DNA结合使LncRNA重塑染色质结构和表观遗传修饰，从而调节靶基因的表达；LncRNA作为分子海绵与mRNAs或miRNAs相互作用，从而调节mRNAs的稳定性和翻译或miRNAs与自身靶点的结合；LncRNA能够与蛋白质结合，调节其构象、定位或稳定性、蛋白质复合物的形成或解离；部分LncRNA含有小的开放阅读框（SORF），编码具有生物功能的肽参与HCC的进展。（图3）
（1）DNA结合和染色质重塑
LncRNA在蛋白质编码区或非编码区通过顺式或反式与DNA结合，调控基因的表达（图3a）。LncRNA XIST通过与DNA结合，在早期发育过程中介导X染色体失活。典型的LncRNA-DNA相互作用位点可能位于某些基因的启动子或其他调控DNA序列（如增强子）中，通过形成RNA-DNA杂交（R-loop）来改变染色质结构，进而提供信号来招募生物分子（如表观遗传修饰剂）来调节基因表达，或在空间上将启动子和增强子/抑制子结合起来调节转录活性。LncRNA-Khps1直接与SPHK1基因启动子相互作用形成LncRNA-DNA结构，招募组蛋白乙酰转移酶p300/CBP激活SPHK1的表达。
在肝癌的发展过程中，发现存在表观遗传修饰剂的失调，如DNMTs、EZH2、HDACs、PCAF。研究发现，这些表观遗传修饰因子可以被肝癌中的LncRNA调节，从而导致表观遗传改变异常，如低甲基化、高甲基化。LncRNA-UPAT可以直接与UHRF1结合，从而保护UHRF1不被降解，促进HCC进展。
（2）mRNA和miRNA的海绵作用
miRNAs结合mRNAs来调节mRNA的转换被证明是调控细胞事件的重要机制。LncRNA可与mRNA相互作用，调节mRNA的稳定性和易位；LncRNA也可发挥miRNA海绵作用，抑制miRNA与其自身靶点的结合（图3b）。LncRNA H19包含两个let-7 miRNA功能结合位点，通过与miRNA结合，从而促进靶mRNA Dicer和Hmga2的表达。LncRNA-miRNA的相互作用，有时是通过改变LncRNA自身的功能而影响细胞过程，而非改变结合的miRNA。LINC00673通过抑制SRC-ERK信号传导发挥抑癌作用，A-G核苷酸突变为miR-1231提供了结合位点，从而miR-1231抑制了LINC00673的抑癌作用。
虽然在HCC中，存在UFC1等LncRNA通过与mRNA稳定蛋白HuR结合，从而稳定β-catenin mRNA，并激活Wnt信号促进HCC进展。但LncRNA更多的是通过对miRNA的调控，间接影响mRNAs的稳定性，而不是直接与mRNA结合。研究发现，miRNA在肝癌发展过程中大部分处于下调状态，可能与miRNA加工过程的缺陷、pre-miRNA核受损、LncRNA介导的miRNA失调有关。LncRNA调控miRNA的机制主要有两种，即表观遗传修饰和充当miRNA海绵。作为miRNA海绵时，LncRNA阻断了miRNA与其靶基因之间的联系，导致部分肝癌相关基因的重新激活。LncRNA-HULC作为miR-186的竞争性内源性RNA，上调HMGA2的表达以促进HCC生长。
（3）蛋白质相互作用与调控
LncRNA可以与蛋白结合，从而调节蛋白的定位和稳定性，以及通过作为支架的功能介导蛋白-蛋白复合物的组装（图3c）。LncRNA XIST在X染色体失活中起着核心作用，通过与LBR结合，引导失活的X染色体定位于核膜上，使XIST在X染色体上扩散，进而转录沉默。这可能与蛋白质与LncRNA的亲和力改变引起。LncRNA HOTAIR可以与组蛋白修饰剂PRC2和LSD1结合，形成新的蛋白质复合物。相反，部分LncRNA可以竞争性地引起蛋白质复合物的分离。
在HCC的发病机制中，上述功能也发挥重要的作用。部分肝癌相关蛋白的亚细胞定位受到LncRNA的调控，LncRNA-MUF与AXNA2相互作用，促进其细胞质移位，进而激活WNT信号促进肝癌进展。 LncRNA还可介导癌蛋白和肿瘤抑制因子的稳定，LncRNA-PRAL促进p53与HSP90的相互作用，从而阻止p53与MDM2的结合，抑制肝癌生长。作为支架，LncRNA HOTAIR可与PRC2和E3连接酶Mex3b结合，促进PRC2的降解，诱导肝癌进展。LncRNA FTX可与MCM2结合，将其从染色质中分离，导致细胞周期停滞并抑制肝癌生长。
（4）编码小肽
最近研究表明，部分LncRNA含有少于100个氨基酸开放阅读框（sORFs），可以产生功能性肽段（图3d）。随着生物信息学和测序技术的发展，更多的之前认为是非编码的转录本被鉴定为sORFs。有研究发现，位于细胞质中约40%的人类LncRNA可能被翻译，但质谱分析只鉴定出很少的LncRNA翻译产物，可能与小肽的快速降解有关。在肝癌发生发展中，有关LncRNA编码的小肽的研究还很有限。可能与小肽的不稳定性、与已经注释的蛋白不同源或没有生物功能有关。
图3 LncRNA在肝癌中的作用机制。（A）LncRNA通过与启动子或远端调控元件结合，与DNA相互作用，调控基因表达；（B）LncRNA与mRNAs结合调节其稳定性，进而调节基因表达；LncRNA还可作为分子海绵与miRNA结合，使miRNA靶向基因重新激活；（C）LncRNA作为支架与蛋白质相互作用，调节蛋白质稳定性或促进蛋白质复合物的形成；（D）部分LncRNA具有编码小肽的潜能，通过小肽发挥其生物学功能。
4.LncRNA作为肝癌标志物中的意义
HCC相关的LncRNA通过不同的机制，促进或抑制HCC的发生，为HCC的治疗提供治疗策略（图4）。
（1）维持增殖信号
细胞增殖通常由受体酪氨酸激酶（RTKs）的激活以及细胞周期进展共同决定。正常细胞限制其增殖以维持生物体的正常结构，而RTKs（如EGFR、c-Met、IGF1R和IGF2R）的结构性激活可导致肝癌等肿瘤的发生。此外，细胞周期检查点异常也被证明与肝癌的发生发展有关。细胞周期由细胞周期蛋白及相关激酶调控，检查点蛋白Cyclin D1, CDK4和CDK6的失调被证明与HCC细胞增殖呈正相关。在HCC中，lnc-EGFR、LINC01225等通过与EGFR互作用，导致其结构性激活，促进肝癌生长。LncRNA-UFC1与蛋白HuR结合，使β-catenin和CDK4/6、c-Myc、cyclin D1等检测点蛋白的表达上调，导致肝癌细胞G1/S期转化和增殖增强。（图4a）
（2）细胞能量失调
癌细胞通过对代谢途径重编程，以提供能量和构建所需元件。涉及的途径包括有氧糖酵解、谷氨酰胺解、脂肪生成等。有氧糖酵解是癌细胞产生能量的主要方式，谷氨酰胺被裂解与NADPH的产生和细胞抗氧化机制相关，脂肪生成可促进膜生物合成和能量储存。LncRNA被认为与代谢酶失调和HCC细胞异常能量模式有关（图4b）。LncRNA TUG1能够刺激miR-455-3p的转录，并下调AMPKβ2的蛋白水平，从而激活HK2表达，提高肝癌细胞的糖酵解能力。LncRNA HOTTIP上调GLS1的表达，从而促进肝细胞癌细胞的谷氨酸分解和增殖。ACSL1可产生用于脂质合成的acyl-CoAs合成酶，LncRNA-HULC通过激活ACSL1调节肝癌中的脂肪生成。
（3）影响肿瘤干细胞
干细胞具有无限复制和分化细胞的能力，对于肝脏的再生能力十分重要。但是，肿瘤干细胞（CSCs）是肿瘤治疗的主要障碍，也是大多数肿瘤耐药和复发的原因。CD133、CD24、EpCAM、ICAM-1等干细胞标志物，已证明在HCC的进展和耐药中起着关键作用。Wnt/β-catenin、JAK-STAT和Hippo-YAP通路也参与HCC干细胞的维持。研究发现，LncRNA能够在转录后或翻译后水平上调节Wnt-β-catenin途径，LncRNA-DANCR可以与β-catenin的mRNA结合以防止被miRNA降解。此外，LncRNA通过促进或抑制IL-6-STAT信号传导，从而上调或下调HCC细胞株，LncRNA-DILC通过抑制IL6-STAT3途径发挥抑癌作用，抑制HCC干细胞的增殖。不仅如此，lncBRM与BRM蛋白相互作用，促进BRG1嵌入BAF复合物的组装，激活YAP1的表达（图4c）。
（4）激活肿瘤转移
肿瘤转移导致大多数癌症恶化。转移始于上皮-间质转化（EMT），随后间充质样细胞侵入血管，细胞对缺氧耐受并转移到远处的器官。研究发现，EMT过程和血管生成被认为是导致肝癌转移的重要事件。部分LncRNA能够调节EMT标记物的表达和血管形成，从而影响HCC转移（图4d）。LncRNA ATB和ZFAS1可以miRNA海绵作用，激活间充质ZEB1，促进肝癌的转移。LncRNA ZEB1-AS1通过提高其启动子活性刺激ZEB1的表达从而促进肝癌的转移，而ZEB1-AS1低甲基化患者与高转移复发和低生存率相关。此外，波形蛋白可以与LncRNA-Dreh相互作用，抑制HCC的发展。
图4 LncRNA作为肝癌标志物的意义。（A）生长因子受体/RTK信号与细胞周期进展异常调控引起持续增殖；（B）代谢重编程引起能量失调；（C）CSC相关信号的过度激活导致干细胞升高；（D）间叶细胞样标志物的过度表达与血管的形成增强肿瘤转移。
5.LncRNA对肝癌的诊断和治疗价值
肝癌的诊断主要依靠超声显像和AFP测定。但对于肝癌早期患者，以上检测的灵敏度较低。目前，切除、肝移植等手术方法是早期肝癌唯一可行的治疗方法，而晚期肝癌基本上无法治愈。
（1）LncRNA作为肝癌潜在生物标志物
与正常肝组织相比，大量LncRNA在HCC中异常表达。但是单独使用LncRNA无法区别肝癌与其他肝脏疾病。目前常用LncRNA联合其他分子，特别是肝癌标志物AFP进行联合预测。除了AFP，miRNAs或mRNAs也可以与LncRNA联合预测HCC。此外，液体活检相比于组织活检，是无创的理想诊断方法。LncRNA UCA1, WRAP53, PVT1和uc002mbe.2存在于体液中，LncRNA-HULC可在血液样本中检测到，并且可通过qPCR检测。进一步研究表明，这些LncRNA来源微泡和凋亡小体等胞外小泡（ev）的分泌，可通过超速离心和过滤分离。
（2）LncRNA作为肝癌治疗靶点
肝癌的预后总体较差，部分原因是因为缺乏治疗靶点。肝癌中最常用的靶向药物是靶向RTKs的索拉非尼，但也常观察到耐药性。LncRNA相比于比蛋白质靶向制剂具有设计简单的优势，主要包括反义寡核苷酸（ASOs）和RNA干扰（RNAi），通过靶向LncRNA对肝癌具有良好的抗癌活性。ASO介导的linc00210沉默被证明可以抑制HCC细胞更新和侵袭，并且RNAi敲除LncRNA-CASC9显著减少HCC小鼠模型中肿瘤的形成。目前以肝癌为靶点的ASOs和RNAi的研究范围很广，已经应用于HBV的治疗。此外，除癌基因LncRNA的敲除外，肿瘤抑制性LncRNA的递送也是一种替代策略。
结论
本文主要介绍了LncRNA在肝癌中的异常表达涉及的主要过程，并总结了LncRNA作为肿瘤抑制因子或致癌基因调控肝癌发生发展的机制。此外，还对LncRNA在肝癌中的诊断和治疗潜力进行了总结。LncRNA正逐渐成为RNA生物学和肿瘤学研究的热点问题之一。LncRNA通过调节其结合分子的表达、定位、稳定性、活性等特性，引起持续增殖、代谢异常、干细胞增多和转移等一系列癌表型，导致肝癌的发生和发展，部分存在于体液中的LncRNA具有单独作为潜在HCC生物标记物或与其他分子联合提高特异性的价值。
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