科研 | 国人一区佳作：全面介绍MicroRNA及其在植物-环境互作中的调控作用
编译：小鹿同学，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：MicroRNAs and Their Regulatory Roles inPlant–Environment Interactions
译名：MicroRNA及其在植物-环境互作中的调控作用
期刊：Annual Review of Plant Biology
IF：18.918
发表时间：2019年3月8日
通讯作者：曹晓风&戚益军
通讯作者单位：中国科学院遗传与发育研究所，中国科学院分子植物科学卓越中心，植物基因组学国家重点实验室和国家植物基因研究中心&清华大学生命科学学院植物生物学中心
要点及待解决问题
要点总结：
MicroRNA（miRNA）的生物形成需要将miRNA基因（MIR）转录成初级miRNA（pri-miRNA），这些初级miRNA被DICER-LIKE（DCL）蛋白共转录为miRNA双链体。剪接因子和套索RNA参与pri-miRNA加工的调控，从而剪接和pri-miRNA加工过程出现交联或偶联。
miRNA双链体被甲基化，并将引导链合并到ARGONAUTE（AGO）蛋白中，以形成miRNA诱导的沉默复合体（miRISC）。传统观点认为，miRNA加载到AGO蛋白中发生在细胞质中。但是，改进的模型描述了细胞核miRNA的装载和装载后AGO1的核输出。
植物miRNA与其靶标显示出近乎完美的互补性，并直接切割靶标信使RNA（mRNA）。而miRNA-介导的翻译抑制也很普遍。内质网是靶标mRNA切割和抑制翻译的一个重要位点。某些miRNA指导细胞核中的DNA甲基化。
miRNA的循环始于SMALL RNA DEGRADING NUCLEASE 1 (SDN1)对miRNA的3’端截短、HEN1 SUPPRESSOR1（HESO1）和URIDYLYLTRANSFERASE 1（URT1）对截短的miRNA的3’端尿苷化，以及未知核酸外切酶对多尿苷化miRNA的降解。
miRNA-介导的发育可塑性是植物应对各种环境刺激（如光、温度和养分）的常见策略。miRNA充当重要的环境响应调节剂，其可以赋予植物的表型适应性变化并促进植物进化和适应。
植物已经进化出miRNA模块，可以精确地调节非生物胁迫-耐受性响应，其中一些与植物的环境适应性进化相关。
miRNA可以直接调节防御反应，也可以充当分子开关，通过靶向R基因来协调植物的生长和免疫。
miRNA可以响应共生和寄生信号，并重新编程一系列分子网络，以促进或抑制共生和寄生器官的形成。
待解决的问题
pri-miRNAs中的哪些序列/结构特征决定了通过切割复合物来进行加工的效率和准确性？RNA修饰是否调节（如果是的话）如何调节pri-miRNA的加工？
2. D-bodies是MIRs和pri-miRNA加工的中心组织吗？D-bodies的形成是否反映了miRNA加工影响因子缩合为阶段性分离的微滴？
剪接在多大程度上以及如何调控pri-miRNA的加工？miRNA的生物形成是否影响（如果是的话）如何影响pre-mRNA的剪接？
许多miRNA加工因子调节pri-miRNA的选定子集加工。是什么决定了不同miRNA加工因子的特异性？
miRNA作用模式选择的决定机制是什么？
为什么只有22个核苷酸的miRNA会引发次级小干扰RNA（siRNA）的产生？
miRNA如何感知环境刺激并调节其积累？
植物物种之间与植物-环境相互作用有关的miRNA-靶标调控因子的自然变异模式是什么？它们是否会（如果是的话）如何对环境适应性做出贡献？
主要内容
植物microRNA的发生和调控机理，microRNA诱导的沉默复合物及microRNA的循环
microRNA基因转录成初级microRNAs
植物中microRNA（miRNA）的产生与动物中一样，通过RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）将miRNA基因（MIRs）转录成初级miRNA（pri-miRNA）。大多数位于基因间区的MIRs通常是一个独立的转录单元，但一些位于蛋白质编码基因内含子序列的MIRs，也可以与其宿主基因进行共转录。
顺式调节元件和反式调节元件在MIR表达的转录调节中起着关键作用。除了TATA框中的核心启动子元件外，拟南芥和水稻的MIR启动子序列富含顺式调节元件。MIR的表达受转录因子的调控，最先阐明这点的研究是MIR156和MIR172的表达受到SQUAMOSA PROMOTER BINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）转录因子的调控。在拟南芥和玉米从幼芽到成熟过程中，miR156的表达随miR172表达的增加而降低。miR156靶向的十个SPL转录因子中的两个，SPL9和SPL10，其解阻遏作用促进MIR172b启动子上这两种SPL的富集，同时激活MIR172的转录。有趣的是，SPL9和SPL10的解阻遏作用也可以促进MIR156a的转录，从而弥补miR156表达的降低并稳定miR156的表达输出。在拟南芥中，研究人员随后确定了转录因子APETALA2（AP2）可以促进MIR156e的转录但抑制MIR172b的转录；FUSCA3促进MIR156a和MIR156c的转录；POWERDRESS促进MIR172a，MIR172b和MIR172c的转录。Ⅱ类和Ⅲ类同源结构域亮氨酸链（HD-ZIP）转录因子在叶片建立前后轴极性的过程中共同抑制MIR165/166的转录。据报道，越来越多的转录因子在响应刺激或压力后动态调节MIR的转录。由于篇幅限制，本综述未对其进行总结。调节特异性MIR表达的转录因子常被其同源的miRNAs靶向，从而形成反馈调节环。尽管某些转录因子特异性地调节某些MIRs的转录，但其它转录因子也会普遍地影响MIR转录。NEGATIVE ON TATA LESS 2和CELL DIVISION CYCLE 5，及MOS4-ASSOCIATED COMPLEX (MAC)的一些亚基，它们与Pol Ⅱ有关，且可以促进MIR的转录。延伸体可与Pol Ⅱ共定位，并且帮助Pol Ⅱ在MIRs上发挥作用。介体是一种蛋白质复合物，其可将信号从转录因子传递到Pol Ⅱ，从而发挥着一种整体转录共激活的作用，且其通常是MIR转录所必需的。
除了顺式调节元件和反式调节元件，调节MIR转录的表观遗传机制也逐渐崭露头角。通过在组蛋白H3，赖氨酸14上沉积乙酰化标记，组蛋白乙酰转移酶GENERAL CONTROL NON-REPRESSED PROTEIN 5可促进MIR的转录。通过调节核小体在MIR启动子上的占有率，以及转录因子对MIR启动子的激活或抑制效率，ATP依赖的SWR1染色质重塑复合物对MIR的转录可能会产生正或负调控作用。如何将MIRs与其它Pol Ⅱ-转录的基因区分开，从而使一些转录因子或表观遗传机制特异性地影响MIR的转录，这仍然是一个悬而未决的问题。
初级microRNAs的加工
拥有5’帽和3’聚腺苷酸化结构的长链初级miRNA形成不完善的折返结构，并依次加工成具有茎环结构的前体miRNA（pre-miRNA），然后形成一个由引导链（成熟miRNA）和随从链（miRNA*）组成的复式结构。与在动物体内细胞核和细胞质中分别使用RNA酶Ⅲ核酸内切酶的两个家族酶（Drosha和Dicer）对pri-miRNA进行加工不同，植物中pri-miRNA的两个加工步骤都是在细胞核中被DICER-LIKE 1（DCL1，属于Dicer的同系物）催化。DCL1与MIR基因座之间的关联表明，pri-miRNA的加工与其转录是同时进行的。尽管大多数miRNAs的长度为21个核苷酸（nt），但由于DCL1对pri-miRNA的替代或不精确加工，通常会产生miRNAs的22-nt异构体。除了DCL1外，DCL3也能够加工pri-miRNAs，并在水稻中产生一类长度为24-nt的miRNAs。
RNA结合蛋白HYPONASTICLEAVES1（HYL1）和SERRATE（SE）与DCL1结合形成切割复合物，其可以视为细胞核中的D- bodies。HYL1可以提高pri-miRNA加工的准确性。SE可能会提高pri-miRNA加工的准确性同时刺激DCL1的活性，但是最近的研究认为SE具有支架功能。
除了HYL1和SE外，过去二十年的研究揭示了大量影响pri-miRNA加工的许多方面因素。转录因子CELL DIVISION CYCLE 5、NEGATIVE ON TATA LESS 2和延伸体与切割复合物相互作用从而促进pri-miRNA的加工。因为它们还与PolⅡ结合并正向调节MIR的转录，因此它们被认为与MIR的转录和pri-miRNA的加工相耦合。此外，MAC7是MAC的一个亚基，与转录延伸有关，它通过促进HYL1向D- bodies的募集来正调控pri-miRNA的加工。SMALL1（SMA1）是一个剪接因子，它可以促进MIR转录并正调控pri-miRNA的加工。CYCLING DOF TRANSCRIPTION FACTOR2通过螯合DCL和YL1来负调控pri-miRNA的加工，同时转录因子PHYTOCHROME-INTERACTINGFACTOR 4在黑暗到红光过渡的期间通过打破DCL1的稳态来负调控pri-miRNA的加工。出乎意料的是，CHROMATIN REMODELINGFACTOR 2可以促进MIR转录，但也释放pri-miRNA，并且通过与SE的相互作用来抑制pri-miRNA的加工。TOUGH，PETROTROPICAL LOCUS1（MAC中保守的WD-40蛋白），DAWDLE（一个叉头相关结构域蛋白），以及MAC3A和MAC3B（MAC中两个U型箱式E3泛素连接酶）也与DCL1互作，且促进pri-miRNA的加工。然而，它们不影响MIR的转录。它们与pri-miRNAs结合，可能也具有稳固pri-miRNAs的作用，同时也帮助DCL1和HYL1去靠近pri-miRNAs。
许多植物的MIR包含需要通过剪接除去的内含子。剪接也可以调节内含子来源pri-miRNAs的产生。因此，剪接和pri-miRNA加工之间的紧密偶联是实现pri-miRNA有效加工的理想方式。实际上，许多因素在剪接和pri-miRNA加工过程中都起着双重作用，许多剪接因子与切割复合体相互作用或共定位，从而调节pri-miRNA的加工。DCL1，HYL1和SE不仅在pri-miRNA加工中起关键作用，而且还参与剪接过程，而且与SE相比，DCL1和HYL1能够介导不同的剪接过程。两个帽结合蛋白CBP20和CBP80、剪接相关因子STABILIZED1、GLYCINE-RICH RBP 7、HIGH OSMOTIC STRESS GENE EXPRESSION5 (HOS5)、ARGININE/SERINE-RICHSPLICING FACTOR (RS) 40和RS41、THO/TREX复合体中的THO2、PRE-MRNA-PROCESSING PROTEIN (PRP)39b,PRP40a, PRP40b、和LETHALUNLESS CBC 7 RL及SMA1均参与剪接和pri-miRNA的加工过程。HOS5、RS40和RS41与DCL1、HYL1相互作用，并在一定程度上对包括内含子MIR，通过促进其转录本中内含子的去除从而调节pri-miRNA的加工。而CBP20，CBP80，AtPRP39b，AtPRP40a，AtPRP40b和AtLUC7r1均与SE相互作用。它们通过确保第一个内含子的5’端剪接位点的正确选择来调节pri-miRNA的加工，这可能会刺激外显子pri-miRNA的加工，但会抑制内含子pri-miRNA的加工。SMA1会与DCL1、SE相互作用，同时通过正调控含内含子pri-miRNA的剪接从而促进pri-miRNA的加工。近期有研究发现突变体中pri-miRNA的加工会受到SICKLE、RNADEBRANCHING ENZYME 1等的影响，这些蛋白参与内含子间套索RNAs的降解。作为pre-mRNA剪接副产物形成的内含子间套索RNAs，同pri-miRNA竞争与切割复合物的结合，同时负调控pri-miRNA的加工。因此，剪接对pri-miRNA加工的影响不仅局限于含内含子的MIRs，也出现在MIR的编码蛋白基因的内含子上。
调节pri-miRNA加工的其他因素包括MODIFIER OF SNC1、2（MOS2）、和SHORT VALVE1（STV1），它们与pri-miRNA结合并通过切割复合物促进pri-miRNA的募集。与大多数miRNA的生物发生因子不同，MOS2和STV1不与切割复合物相互作用。但是，D- bodies的形成需要MOS2。THO 2（THO/ TREX复合物的一个亚基），发挥着与MOS2和STV1类似的作用，但它也可能通过影响剪接过程来调节pri-miRNA的加工。
XAP5 CIRCADIAN TIMEKEEPER通过促进DCL1的转录来调节miRNA的形成。除了直接调节pri-miRNA加工外，CYCLING DOF TRANSCRIPTION FACTOR2还通过上调多种pri-miRNA加工影响因子的表达来间接调控miRNA的形成。SMA1还通过促进DCL1 pre-mRNA的剪接来增加miRNA的生物形成。DCL1 的mRNA水平受到直接靶向DCL1的miR162的负反馈调控。KARYOPHERIN ENABLING THETRANSPORT OF THE CYTOPLASMIC HYL1促进HYL1的核输入从而促进miRNA的生物形成。此外，一些因子调节pri-miRNA加工影响因子的翻译后修饰水平同时调节其活性。与CPL2冗余起作用的C-TERMINAL DOMAINPHOSPHATASE-LIKE 1 (CPL1), 使HYL1去磷酸化，从而促进HYL1定位于D- bodies之上，增加HYL1的活性，进而促进pri-miRNA的精确加工。CPL1还使HOS5去磷酸化并促进HOS5定位于细胞核核斑上。在幼嫩的植物营养和生殖组织中，HOS5是CPL1和CPL2对HYL1进行去磷酸化所必需的因子。除CPL1和CPL2外，SUPPRESSOR OF MEK 1与PROTEIN PHOSPHATASE 4协同作用，对HYL1去磷酸化，稳定HYL1并加强pri-miRNA的加工。在脱落酸（ABA）处理后的响应，SUPPRESSOR OF MEK 1被诱导拮抗MPK3引起的HYL1磷酸化，同时防止HYL1失去稳态。在从黑暗中恢复的过程中，HYL1被去磷酸化，miRNA的生物形成也被重新激活。除MPK3外，SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 2还使HYL1和SE磷酸化。然而，与MPK3相比，SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 2介导的HYL1磷酸化有利于HYL1在脱落酸响应中的积累。综上所述，pri-miRNA的加工是一个高度协调和精确调节的过程，涉及到许多蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA之间的相互作用。然而，目前为止还不清楚pri-miRNA的确切加工位置。由于许多pri-miRNA加工因子定位于D- bodies之上，因此有人提出D- bodies是pri-miRNA加工发生的部位。然而，每一个细胞核中pri-miRNA加工的许多情况和可检测到D- bodies的有限数量与该理论相悖。
在pri-miRNA加工后，从切割复合物中清除SE，同时HUA ENHANCER 1 (HEN1)代替SE来结合DCL1 / HYL1复合物，并在miRNA双链体的3’端催化2’-O-甲基化，从而提高miRNAs的稳定性。
MicroRNA诱导沉默复合物的组装
甲基化的miRNA双链体需要加载到ARGONAUTE（AGO）蛋白中，以形成效应子复合物miRISC。通常选择5’末端具有较低热力学稳定性的链作为引导链。HYL1、CPL1、HOS5、RS40和RS41有助于正确的选择引导链。组装后，miRNA双链体解开，并将miRNA链整合到AGO蛋白中。5’末端的核苷酸在很大程度上决定了AGO蛋白的选择。在拟南芥中，绝大多数miRNA链以5’端尿苷开始，并优先装入AGO1蛋白（AGO蛋白家族的最先发现成员）。而miRNA双链体结构对于AGO蛋白的选择也很重要，且miRNA可以装载到AGO蛋白家族的其它成员之上。miRNA*链通常被降解。但是，miRNA*s也可以富集并加载到AGO蛋白中，从而在特定植物组织和/或一定压力条件下抑制基因的表达。
AGO1-miRISC的组装需要分子伴侣HEAT SHOCK PROTEIN 90 (HSP90) (90)。CYCLOPHILIN 40与AGO1-HSP90复合物瞬时缔合并促进AGO1的装载。参与细胞核内蛋白质内输的两个β-内输蛋白家族成员，ENHANCEDMIRNA ACTIVITY 1和TRANSPORTIN 1，并不会改变AGO1的胞质-核分布，但分别对AGO1的装载具有负调控和正调控作用。AGO1的水平也会影响miRISC的组装。AGO1的动态平衡需要通过与AGO1结合的miR168进行负反馈调节。有趣的是，由于pre-miR168的结构灵活性而产生miR168的22-nt异构体却会优先加载到AGO10中，从而沉默AGO1基因的表达并通过诱发次级小干扰RNA（siRNA）的产生来拮抗AGO1的累积。
在早期的模型中，miRNA双链体通过HASTY作用部分地运输到细胞质中，然后加载到AGO1蛋白上。但是，最近的一项研究提出了一种改进的模型，即AGO1蛋白的加载发生在细胞核中。核定位信号和核输出信号（NES）直接指导AGO1蛋白进行细胞核质穿梭，且即使由于NES的突变使AGO1蛋白停留在细胞核内，miRNAs也可以装载到AGO1中。此外，协助AGO1装载的分子伴侣HSP90（90）与停留在细胞核内的AGO1蛋白可以产生共免疫沉淀。NES在核定位信号中占优势，而野生型AGO1蛋白主要存在于细胞质中，这一事实提出了一个问题，即如何将未装载的AGO1蛋白保留在细胞核中以便装载。根据计算预测，在miRNA装载到AGO1蛋白之前，AGO1的NES处于隐藏状态，从而允许AGO1蛋白定位在细胞核中。miRNA的加载引发了NES的暴露，从而使装载过的AGO1蛋白在CRM1 / EXPORTIN1协助下运输到细胞质中。
microRNA的循环
在拟南芥中，未甲基化的miRNA双链体被DEDDy-型3’到5’端的核糖核酸酶ATRIMMER2降解。甲基化的游离miRNA和与AGO结合的miRNAs也会发生降解。甲基化miRNA的降解分为三个步骤：（a）甲基化的、游离的或与AGO1结合的miRNA的3’端截短；（b）截短的miRNA的3’端尿苷化；（c）截短和尿苷化的miRNA的降解。
3’到5’端的SMALL RNA DEGRADING NUCLEASE 1(SDN1)可以在体外截短2-O-甲基化的RNA寡核苷酸和2-O-甲基化的AGO1结合的miRNAs。SDN1和SDN2基因的同时突变不仅会导致hen1突变体中3’端截短miRNAs的积累减少，从而使miRNAs失去2-O-甲基化依赖性保护，而且还会降低野生型菌株遗传背景下3’端截短miR165和miR166的水平。这些发现表明，SDN1和SDN2可能与体内miRNAs的3’端截短有关。
末端尿嘧啶转移酶HEN1 SUPPRESSOR1（HESO1）和UTP：RNAURIDYLYLTRANSFERASE 1（URT1）在体外催化未甲基化的RNA寡核苷酸和结合-AGO1且未甲基化的miRNAs的3’端尿苷化。HESO1和URT1优先尿酸化3’端分别带有U和A的miRNAs。这可能是因为它们具有不同的底物特异性，所以当两者同时存在时其3’ 端加尾效率更高。在体内时，URT1可能首先单尿苷化未甲基化的miRNAs，接着HESO1尿酸化这些miRNAs。但是，与utr1突变体相比，HESO1基因的突变会影响大量miRNAs的3’端加尾，这表明HESO1可以与其它末端尿嘧啶转移酶协同或单独进行3’端加尾。
目前尚不清楚植物中降解多尿苷化miRNAs的核酸外切酶的身份。根据在绿藻、酵母和哺乳动物等中的发现，SUPPRESSOR OF VARICOSE和RIBOSOMAL RNA-PROCESSING PROTEIN 6-LIKE (RRP6L)，拟南芥同源物DIS3-LIKE 2和RRP6，均可能是降解多尿苷化miRNAs的候选者。
植物microRNA作用的机制和调控
目标信使RNA的裂解
大多数植物miRNAs与其靶mRNAs之间的配对会导致靶miRNAs在配对区域处被切割，从而产生5’和3’端切割片段。AGO蛋白的PIWI结构域（其形成一个类似于RNase H的折叠）构成了催化中心。拟南芥的AGO1，AGO2，AGO4，AGO7和AGO10蛋白等都具有切割活性。
在膜结合的多核糖体部位检测到miRISC的 3’端裂解产物提供了重要的证据，证明靶mRNA的裂解发生在粗糙的内质网（ER）上。此外，在3-HYDROXY-3-METHYLGLUTARYLCoA REDUCTASE 1（合成生物膜基本成分所需的酶）的突变体中，AGO1与膜的结合减少，与靶mRNA裂解受影响相吻合，这表明ER定位是miRNA介导的靶mRNA切割所必需的。
大多数5’端和3’端裂解产物被核酸外切酶降解。未加帽的3’ 端裂解产物是5’ 端至3’端外切核糖核酸酶的合适底物。3’端裂解产物中的一部分，包括那些具有独特序列特征的裂解产物和那些由特定功能基团的基因产生的裂解产物，被胞质中EXORIBONUCLEASE4降解，而其余的则被尚未鉴定的核酸外切酶降解。加帽的5’端裂解产物首先被HESO1尿苷化，接着被RISC-INTERACTING CLEARING 3’-5’EXORIBONUCLEASE 1 (RICE1)和RICE2降解。RNA外泌体辅因子SKI2、SKI3和SKI8对于尿苷化5’端裂解产物的降解也是必需的。然而，CSL4（RNA外泌体的非催化成分）和RRP6L（与RNA外泌体缔合的核亚基）对于RISC 5’端裂解产物的降解并不是必需的。
被22-nt miRNAs靶向的转录物裂解产物没有被降解，而是在SUPPRESSOROFGENESILENCING3的作用下得以稳定，并被byRNA-DEPENDENTRNA POLYMERASE 6转化为双链RNA。这些双链RNAs随后通过DCL4加工成21-nt阶段次级siRNA（phasiRNAs），比如miRNAs，其能够引导AGO1切割它们的靶mRNAs。
翻译抑制
miRNAs还可以通过翻译抑制来下调基因的表达。尽管靶mRNA的切割会导致靶mRNAs的水平降低，但是翻译抑制导致从靶mRNAs翻译而来的蛋白质积累减少。靶mRNA裂解和翻译抑制的同时发生会导致蛋白质水平相对于mRNA水平出现成比例的下降。在动物中，miRNA及其靶标之间高度的序列互补性有利于靶mRNA的切割，而错配的miRNA /其靶标序列经常与翻译抑制相关。在植物中，大多数miRNAs及其靶标之间具有近乎完美的序列互补性。但是，平移抑制现象普遍存在，且占主导地位。HYL1（也称为DRB1）是miRNA生物合成和miRNA-介导的靶mRNA切割所必需的，而DRB2（另一个与DCL1互作的DRB家族成员）决定了miRNA-介导的翻译抑制。DRB2抑制HYL1表达，从而促进翻译抑制模式的选择。但促进翻译抑制模式选择的其他机制仍然未知。
AGO1-、AGO7-和AGO10-miRISCs可以进行翻译抑制。AGO1-miRISC发挥的翻译抑制机制取决于miRNA目标位点的位置。靶向5’端不翻译区域（UTR）的AGO1-miRISC阻止了核糖体的募集和翻译起始，而靶向开放阅读框的AGO1-RISC能够阻止核糖体的移动和翻译延伸。尽管这些RISCs影响蛋白质翻译的不同步骤，但它们对蛋白质翻译的抑制作用可能都是由位阻现象导致的。AGO1和miRNAs与多核糖体的结合支持了位阻理论。结合3’端UTR的AGO1-miRISCs也会抑制翻译起始。但是，与5’端UTR结合的AGO1-miRISCs抑制（为帽依赖翻译和帽不依赖的翻译）不同，3’端UTR结合的AGO1-miRISCs仅抑制帽依赖型的翻译。因此，3’端结合UTR的AGO1-miRISCs必然会影响帽依赖型翻译所特有的步骤。
已经确定了选择性调节翻译抑制的多种因素，包括KATANIN、VARICOSE、SUO和ALTERED MERISTEM PROGRAM1（AMP1）。AMP1是一个整合到粗糙ER膜上的蛋白质，其可以防止miRNA靶转录物与结合到ER膜上的多核糖体之间缔合，从而阻止miRNA靶转录物的翻译。VARICOSE与哺乳动物体内的去帽催化剂Ge-1是同源物。SUO是一种大蛋白，可以与去帽激活剂DCP1共定位。鉴定VARICOSE和SUO为调节miRNA-介导的翻译抑制因子，这表明该过程涉及到mRNA的去帽。KATANIN是微管切割酶的一个亚基，表明在植物中微管动力学以某种方式协助miRNA介导进行翻译抑制。
ER膜蛋白AMP1与来自膜结合多核糖体的miRNA靶转录本进行螯合，这提供了重要的证据，证明miRNA-介导的翻译抑制发生在ER上。mRNA去帽所需的P-body-定位蛋白VCS、SUO以及AGO1蛋白与粗糙ER、P-body之间的关联表明，P-body的某些成分可能会影响ER中miRNA-介导的翻译抑制或P-body也是miRNA-介导的翻译抑制的位点。
DNA的甲基化
目前关于miRNA依赖型DNA的甲基化研究数量有限。但是，两项不同的研究提供了令人信服的证据，证明miRNA能够指导DNA进行甲基化。Bao等人发现PHB和PHV基因的甲基化需要PHB、PHVmRNA和miR165/166之间具有互补性。在水稻中，一部分pri-miRNAs可以在DCL1和DCL3的作用下分别加工成规范的miRNAs（21 nt）和长链miRNAs（24 nt）。这些长链miRNAs（与RNA指导DNA甲基化途径中的异染色质的siRNAs相似）被分选到效应器AGO4中，并可能与目标基因座衍生的转录本进行碱基配对，从而指导DNA进行甲基化。这些发现表明，指导DNA进行甲基化是miRNA作用的另一种模式，它不在转录后水平，而是发生在转录水平上，这进一步增加了miRNA-介导的基因表达调控的复杂性。未来的研究应该调查miRNA这种作用模式的普遍性。miRNA生物形成的主要步骤以及在这些步骤中发挥的作用和影响因素如图1所示。
图1. 模型描述了miRNA的生物合成（①）、miRISC的组装（②）及miRNA的作用及循环（③，④）。MIRs首先通过RNA PolⅡ转录成pri-miRNAs。pri-miRNAs接着通过两个步骤分别被DCL1或DCL3分别加工成长度为21-nt和24-nt的miRNA双链体。HYL1和SE通过形成一种DCL1的切割复合体促进pri-miRNA的加工。Pri-miRNA的加工以一种转录-剪接耦合的方式进行，同时需要很多转录调节因子和剪接影响因子调节这一过程。调节关键pri-miRNA加工影响因子水平、翻译后修饰或活性的蛋白质也能够调节pri-miRNA的加工过程。HEN1催化miRNA双链体3’端核糖体的2’-O-甲基化。尽管24-nt miRNAs可能会在细胞质中装载到AGO4中，然后重新进入细胞核中从而介导DNA的甲基化，但是21-nt miRNA双链体通过HST到细胞质中以进行miRISC的组装，从而在内质网上指导靶标mRNA的切割和翻译抑制。或者，21nt miRNA在细胞核中加载到AGO1蛋白上，然后通过CRM1（EXPO1）导出。miRISC的切割产物被XRN4和RICE1/2降解。miRNA的循环需要SDN1-介导的3’端截短、UTP：RNA URT1-和HESO1-介导的3’端尿苷化。miRNA生物合成与miRNA循环之间的平衡决定了miRNAs的稳态水平。
MicroRNA活性的调节
不仅miRNA的生物合成，而且miRNA的活性都受到严格的调控。除AGO1蛋白以外的AGO蛋白可以螯合某些miRNAs，从而阻断miRNA的活性。 AGO10蛋白在芽和花分生组织细胞中表达，然后在子叶和叶原基的近侧表达。在茎尖分生组织发育过程中，它特异性的螯合miR165/166，从而防止miR165/166在AGO10蛋白的表达区域抑制HD-ZIPIII基因的表达，并促进茎尖分生组织的发育。miR165/166与AGO10的结合甚至会引发miR165/166的降解，从而导致miR165/166的累积减少。病毒感染后，AGO18与miR168螯合以抑制AGO1的表达，从而增强水稻中的抗病毒RNA干扰。同样，miR528被AGO18螯合，导致L-ASCORBATE OXIDASE的表达降低，活性氧（ROS）的产量增加，同时增强了植物对病毒的抵抗力。
靶标模拟也可作为负调控miRNA活性的一种机制。RNA INDUCED BY PHOSPHATESTARVATION1 (IPS1)诱导的非编码RNA与miR399是互补的，但由于miRNA切割位点的一个错配环而无法被其切割。在磷酸盐缺乏的条件下，IPS1可以被诱导与miR399螯合，并通过miR399的积累来防止PHOSPHATE 2（PHO2）mRNA的持续裂解，从而实现对芽内磷酸盐含量的稳态控制。全基因组计算分析进一步确定了许多长的非编码RNAs和编码蛋白质的转录本，它们可以作为拟南芥和水稻的内源性miRNA靶标模拟物。
植物与环境相互作用中MicroRNA的生物学功能
miRNAs是植物发育过程中的关键调控因子。miRNAs在植物发育中的作用已经有了很好的综述。在本文中，研究者总结了miRNAs在表型可塑性、非生物/生物响应以及共生/寄生互作中的功能。
MicroRNA在发育可塑性中的生物学功能
miRNA不仅充当植物发育过程中的主要调节剂，而且还参与调节各种环境刺激（例如光，温度和营养素）引发的表型可塑性。
光：miR156是进化过程中最保守的miRNA，其靶向SPL基因的一个子集。除了在植物发育的阶段过渡中发挥作用外，miR156-SPLs模块还发挥着避荫综合症的负调控作用，这是植物避免被遮荫或与相邻植物争夺阳光的自适应策略。在拟南芥中，荫蔽可以激活PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs（其直接与MIR156s结合并转录抑制MIR156s的表达），从而导致SPLs基因的上调。SPLs蛋白介导各种形态学上的变化，这些变化与避荫综合症响应的增强有关。
在拟南芥中进行UV-B辐射后，miR396可以被诱导表达从而抑制其靶标GROWTH REGULATINGFACTORs (GRFs)。 通过靶向GRFs，miR396介导了叶片生长的抑制，这是植物阻止细胞周期的一种自适应策略，从而有时间修复UV-B造成的DNA损伤。
在水稻中，miR2118靶向长的非编码RNA（PHOTOPERIOD-SENSITIVE GENIC MALESTERILITY 1 TRANSCRIPT (PMS1T)），并在长期诱发phasiRNAs的产生，导致对光周期敏感的雄性植株不育。在农垦58S品系中，编码PMS1T基因座的单核苷酸多态性可能介导miR2118对PMS1T基因的识别，以及对光周期敏感的雄性不育，这是一种很有价值的种质资源，最初用于水稻的两系杂交育种。
温度：在拟南芥中，miR156和miR172具有温度响应性，在暴露于低温环境后能够协调好开花的时间。这是植物响应温度波动时具有的最引人注目的热适应策略之一。miR156和miR172已经被用于定义正常生长条件下，众所周知的年龄依赖型开花途径。随植物年龄变化，miR156的水平下降会导致SPLs基因的上调，从而通过直接激活关键开花基因（如LEAFY、FRUITFULL和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OFCO 1）的表达来加速开花过程。SPLs还通过miR172-介导的AP2阻遏来诱导开花诱导剂FLOWERING LOCUS（FT），从而直接激活MIR172以促进开花。为了响应较低的环境温度，miR156被上调并且主要用来抑制SPL3。SPL3的抑制导致FT和FRUITFULL的下调以及开花时间的延迟。miR172的下调与miR156的上调同时发生。 miR172的下调又反过来激活AP2以抑制FT，从而产生对开花调控的适应性抑制。miR172的下调主要是由FCA积累的减少引起的，而FCA是一种可以与pri-miR172结合并促进pri-miR172加工的RNA结合蛋白。
硝酸盐和铝：在响应各种环境刺激时，几种miRNA调节模块在根系生长结构（RSA）的修饰中起着重要作用。RSA的许多发育可塑性是通过miRNA-介导的生长素信号传导调节来实现的。保守的miR167通过靶向AUXIN RESPONSE FACTOR 8 (ARF8)负调节生长素信号的传导。拟南芥在较高的硝酸盐条件下，miR167的水平下降，使ARF8在中柱鞘和侧根冠中积累，从而增强了生长素信号传导，进一步促进了侧根的萌生，但抑制根的伸长。这个过程代表了植物采取的一种策略，用来调整其对营养成分作出的发育响应（图2）。与增加的生长素信号传导一致，拟南芥中在早期硝酸盐响应期间就诱导了生长素受体AUXIN SIGNALING F-BOX 3（AFB3）基因。但是，在硝酸盐还原和同化过程中形成的某些代谢产物可以诱导miR393的表达从而抑制AFB3表达。因此，AFB3-介导的植物生长素信号转导的增加和响应硝酸盐变化而进行的RSA修饰是短暂的。与拟南芥硝酸盐代谢过程中的miR393诱导相反，大麦在毒性铝的胁迫下miR393被下调。miR393靶向生长素受体基因TRANSPORT INHIBITORRESPONSE1（HvTIR1）和HvAFB产生的抑制作用减缓能够增强生长素信号传导，并有助于通过铝胁迫来抑制根的伸长（图2）。通过调节RSA的发育可塑性，miRNA-介导的环境刺激和植物激素信号传导（例如生长素信号传导）的整合可促进植物适应动态变化的环境（图2）。
图2. 整合了环境刺激和生长素途径的miRNA模块。miR160、miR167、miR390和miR393等miRNAs通过靶向生长素途径的基因来响应环境刺激，并微调生长素信号的传导，从而赋予植物热/冷耐受性、抗菌感染、共生结节/丛枝的形成、寄生虫胆的形成和根系的可塑性。TIR1/AFB编码一种植物生长素受体；IAR3编码吲哚-3-乙酸–丙氨酸水解酶，该酶能够从非活性储存形式释放具有生物活性的生长素。flg22（来源于真细菌鞭毛蛋白的22个氨基酸肽段）可以被宿主植物感知并触发基础免疫。AM真菌通过形成丛枝与宿主植物产生共生互作。RKN通过形成“胆”觅食结构而与宿主植物产生寄生互作。
MicroRNA在非生物胁迫响应中的生物学功能
植物由于固定位置生长而持续处于不利条件下，例如极端温度、高盐、干旱和营养缺乏。这些非生物胁迫是限制植物地理分布和产量的主要因素。为了减少这些非生物胁迫的不利影响，植物已经进化出特定的机制，使其能够耐受胁迫条件并且生存下去。miRNA-介导的基因表达调控是植物应对非生物胁迫的重要机制。
冷和热：植物对热胁迫的响应包含诱导HSPs蛋白以保护细胞内蛋白质不变性。植物也可以进行热应激启动，其中植物回归到适合环境后能够获得更高的胁迫耐受性。多种miRNAs参与这些热响应。拟南芥的miR398参与了基本的耐热反应。两种热激转录因子能够诱导MIR398基因的表达，而miR398依次抑制其靶基因COPPER/ZINC SUPEROXIDEDISMUTASE 1 (CSD1)、CSD2和COPPER CHAPERONE OF CSD，其抑制作用通过增加热激转录因子和HSPs蛋白的表达来提高耐热性。与野生型植物相比，表达抗miR398的CSD1、CSD2和CSD COPPER CHAPERONE转基因植物对热更敏感，并且展现出热激转录因子的急剧减少。在棉花（陆地棉）中，miR160通过靶向ARF10/16/17来介导生长素信号传导的抑制作用，从而导致棉花在高温胁迫下的花药育性（图2）。然而miR160在耐热棉中被下调，但其过表达会增加植物的热敏感性。
miR156-SPLs模块可能有助于植物的热应激启动。在拟南芥中，反复出现的热应激诱导了miR156，其作用是保持热应激记忆。在这个过程中，SPLs可能充当转录阻遏物，从而抑制参与热应激记忆过程的某些基因。由miRNAs介导的另一种适应策略是在耐热农作物向日葵中发现的，这种向日葵进化出特殊的miR396-HaWRKY6调控模块，该模块可能在植物生长发育过程中起到高温保护作用。实际上，表达抗miR396的HaWRKY6转基因植物出现耐热性受损的现象。
在植物中，冷胁迫能够诱导出一套不同的响应。在甘蔗和水稻中，冷胁迫诱导了在进化上十分保守的miR319表达。miR319的过表达下调了TEOSINTE BRANCHED1、CYCLOIDEA, PROLIFERATING CELLNUCLEAR ANTIGEN BINDING FACTOR这两个基因并增强两个物种的耐冷性，这表明miR319可以作为耐冷性的正向调节剂。通过靶向生长素受体基因TIR1/AFB，冷诱导的miR393也可以正调控柳枝稷草的耐冷性（图2）。miR393过表达或TIR1/AFB突变会增强植物耐寒性，并伴随着冷应答基因表达的增加。
干旱：为了适应干旱条件，植物通过抑制初生根的生长并增加侧根的发育来最大程度地吸收水分，从而修饰其RSA。作为众所周知的侧根形成的形态发生诱因，具有生物活性的生长素吲哚-3-乙酸（IAA）的积累有助于RSA的塑性变化。 在拟南芥中，miR167a被下调，其靶向IAA-ALA RESISTANT 3基因（编码IAA-Ala水解酶，从非活性储存形式的生长素中释放IAA），该基因被抑制从而促进IAA积累和侧根发育（图2）。
miR165/166通过靶向编码HD-ZIP III转录本的方式，成为植物生长和发育过程中重要的调节剂。这些miRNA还负调控植物的干旱耐受性。miR165/166的下调赋予拟南芥和水稻抗旱性的增强，这可能是HD-ZIP III-介导的ABA水平升高的结果。在拟南芥中，干旱也能下调miR169的表达，从而诱导NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTOR Y SUBUNIT ALPHA 5（NFYA5）的产生。NFYA5的过表达增强了植物抗旱性，而nfya5突变株和miR169过表达的植物对干旱表现出高度敏感性，这表明NFYA5赋予了植物抗旱性。NFYA5可能通过介导胁迫应答转录级联反应来实现该功能。大豆的miR169-GmNFYA3模块也具有耐旱性，这表明miR169-NFYA模块在植物抗旱性中的调控作用是保守的。除了下调miR169之外，植物还进化出其它机制来确保干旱条件时能够诱导NFYA5。在拟南芥中，NFYA5的反义基因ENHANCING RING FINGER (NERF)可以产生与miR169具有类似序列但不能指导NFYA5 mRNA切割的siRNA。通过与miR169的竞争，NERF siRNA可以防止miR169-介导的NFYA5表达抑制。这种机制有助于NFYA5-介导的干旱耐受性，这种现象可以通过NFYA5的高积累和NERF过表达品系中干旱耐受性增强以及NERF敲除品系中表型相反来证明。最近，杜等人证明了拟南芥中的脱水休克反应诱导了miR169i和miR1691并通过翻译激活的方式正调控NFYA5基因的表达。
营养不足：为了在各种条件下成功生长，植物必须能够克服营养缺乏症；此外，为了以最少的营养吸收获得高产量，农作物必须有效地利用养分。在低营养条件下，一小部分miRNA被鉴定是介导营养稳态转录后调控的主要调控因子。这些miRNA的鉴定拓宽了研究者对营养饥饿反应分子机制的理解，同时可以为作物营养利用效率的提高提供相关信息。
一些miRNA调节模块会影响一般养分的吸收。最近研究发现，miR166靶向RICE DOF DAILY FLUCTUATIONS 1 (RDD1)，其编码Dof转录因子。 miR166-介导的调节导致RDD1昼夜摆动的表达模式。在低营养条件下，抗miR166 RDD1的过表达显着增加了营养离子（NH4 +，PO4 3-和K +）的吸收和积累，这表明miR166-RDD1操纵子可以应用于水稻育种中，从而提高营养的利用效率。
相反，其它模块会影响特定的营养素。miRNA-介导的调节影响大量营养素（如磷酸盐、氮和硫）以及微量营养素（如铜）的摄取。
磷酸盐：磷（Pi）是所有活体生物中大分子生物合成、能量转移、酶活和信号转导必不可少的重要营养素。此外，磷的水平经常限制农作物的产量。拟南芥中发现的第一个参与Pi-饥饿反应的miRNA是miR399。在Pi充足的条件下，假定的泛素结合酶PHO2将多泛素添加到Pi转运蛋白PHOSPHATE TRANSPORTER 1（PHT1）上，并靶向PHT1从而进行降解，以保持最佳的Pi吸收率。低浓度的磷胁迫强烈诱导拟南芥和水稻中的miR399从而下调PHO2。miR399对PHO2的下调会增加PHT1的水平，从而增加Pi的吸收和转运。在正常条件下，miR399的过表达会导致植物芽中Pi的过度积累并呈现出Pi中毒的症状，这种现象类似于拟南芥和水稻中PHO2基因的突变。
在植物遇到Pi不足的条件时，miR399在表达PHO2的血管组织中积累，并且通过相互嫁接实验能够表明miR399可以从嫩芽转移到根部。这表明miR399在低Pi条件下能够作为系统信号来调节Pi的吸收和转运。在早期Pi饥饿响应中miR399的转移至关重要，因为与拟南芥新芽中MIR399的表达相比，其在根部的早期表达很低。随着Pi饥饿响应的进行，miR399在根和芽中积累的增加会导致植物对Pi的过度吸收；负调节剂可能起到拮抗miR399-介导的Pi收集和转运的作用。IPS1就是一种这样的负调节剂，它是一种非编码RNA，具有与miR399互补的序列。在拟南芥中，Pi缺乏时可以诱导IPS1的表达。由于miR399- IPS1碱基互补配对区域中有一个凸起，IPS1被隔离，而不是被miR399切割。IPS1敲除植株在嫩芽中积累过量的Pi，这表明在Pi饥饿响应期间IPS1对维持Pi稳态具有关键调节作用。
几种植物中的Pi缺失也会强烈地诱导进化上保守的miR827。在拟南芥中，miR827靶向NITROGEN LIMITATION ADAPTATION (NLA)（编码泛素E3连接酶）。与miR399-PHO2模块功能相似，miR827-NLA模块也调节Pi转运蛋白PHT1的泛素化，从而在Pi饥饿响应期间平衡Pi的吸收和转运。值得注意的是，与拟南芥中的miR827-NLA模块相反，水稻中miR827并不靶向NLA的同源物，而是靶向PHT5家族的两个成员（充当液泡Pi转运蛋白），以介导Pi在水稻和拟南芥中的存储或迁移。最近，基于靶标预测分析，Lin等人发现miR827在大多数被子植物中保守地靶向PHT5的同源物，但在十字花科和豆科植物中优先靶向NLA的同源物，这表明在进化过程中miR827的靶标已经从PHT5转移到NLA。这种新的miRNA-靶标模块采用了不同的调节机制，但仍参与到与其原始模块相同的生物学过程中，这表明miR827对调节细胞内Pi稳态的重要性。
氮和硫：氮是限制植物生长和作物产量的另一个因素。硝酸盐缺乏会诱导多种植物中miRNA表达的变化。当硝酸盐缺乏时，拟南芥表现出miR169a的下调同时上调其靶标蛋白——NFYA家族成员。miR169-NFYA模块可能调控硝酸盐吸收系统的适应性响应，这从以下现象中可以看出：miR169的过表达减少了多种硝酸盐转运蛋白基因的表达并且能够引起早期衰老的表型。小麦中也发现了miR169-NFYA响应硝酸盐饥饿时具有相同的调节作用，同时该模块还显示出对低浓度可利用磷的响应。在不同水平的养分供应田间试验中，TaNFYAB1的过表达显着增加了硝酸盐和磷酸盐的吸收以及谷物的产量，这表明miR169-NFYA模块在以较少肥料投入为目标的高产育种中具有巨大潜力。实际上，基于对硝酸盐和磷酸盐不足时具有相似的响应，可以把更多的miRNA模块（包括miR827-NLA和miR444-ANR1）作为提高植物养分利用率的工程目标。
可利用的硫还能调节植物的生长，活力和农作物产量。当硫缺乏时，拟南芥和水稻均强烈地诱导miR395去靶向ATP硫酸化酶和SULFATE TRANSPORTER2；这两者都是硫酸盐代谢途径的关键因素，并且能够介导硫酸盐的同化和吸收或转运。在拟南芥和水稻中过量表达miR395的植物均表现出S饥饿症状，这进一步证明miR395充当了植物硫响应和代谢的负调节剂。由此可以提出了一个问题，即为什么当硫缺乏时会诱导出负调节剂。由于SULFUR LIMITATION 1（硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶的转录激活因子）介导miR395的转录激活，而miR395可能被诱导以维持硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶的最佳水平，从而在低硫条件下实现硫稳态。拟南芥在缺硫条件时，氧化还原信号也可以诱导miR395的表达，这表明在响应硫缺乏时，miR395的表达时一个复杂的调节过程。
铜：铜是植物必需的微量营养素。它在光合作用和呼吸作用的电子运输中ROS的清除、细胞壁代谢和乙烯感知中起着重要作用。植物已经进化出一组miRNAs去下调可分配的含铜蛋白质以应对铜缺乏的情况，从而节省铜用于必需的生物过程（例如光合作用）。铜响应性miRNA包括miR397、miR398、miR408和miR857。当响应铜缺乏条件时，所有这些miRNA均被转录因子SPL7诱导转录，该转录因子是一个保守的铜感应因子，就像其绿藻同源物COPPERRESPONSE REGULATOR 1。miR398的诱导导致CSD1和CSD2的下调，它们是拟南芥中ROS清除和氧化应激耐受性过程中重要的含铜蛋白。miR397、miR408和miR857下调了可分配的含铜蛋白质plantacyanin和漆酶。与单细胞绿藻相比，当铜不足时高等植物缺乏COPPERRESPONSE REGULATOR 1-介导的铁依赖性细胞色素c6途径从而用于光合作用，且高等植物对铜的需求更大。高等植物中进化的SPL7-miRNA含铜蛋白质模块可能代表了一种适应性调控级联反应，以满足铜缺乏条件下光合作用的铜需求。因此，miR408的过表达可以增强各种高等植物的光合作用、生长和产种量。
MicroRNA在生物胁迫响应中的生物学功能
在自然界中，植物不断受到病原体的攻击，其中包括真菌、细菌、病毒和昆虫。miRNA是介导植物对生物胁迫免疫响应的重要参与者。到目前为止，至少有21种miRNA-靶标模块参与到植物对病原体的防御过程。许多miRNA途径的突变体，例如dcl1、hen1和ago1，出现了对细菌或病毒抵抗力下降的现象。
抗细菌和抗真菌免疫力：受到细菌和真菌的攻击后，宿主植物可以识别保守的相关病原体的分子模式（PAMPs），并激活基础防御PAMP-触发的免疫（PTI）。在拟南芥中，miR393被PAMP鞭毛蛋白（flg22）诱导转录，从而下调F-box生长素受体TIR1，AFB2和AFB3的水平；抑制植物的生长素信号；且有益于植物防御致命的细菌性病原体Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（图2）。miR160a被诱导并且通过靶向ARFs、增加胼胝质的沉积从而帮助PTI。在水稻中，miR398b被诱导防御稻瘟病菌Magnaportheoryzae，从而帮助PTI。水稻亚种特异性的miR7695靶向NATURAL RESISTANCE-ASSOCIATEDMACROPHAGEPROTEIN 6的可变剪接转录本，从而赋予植物对M. oryzae的抗性。在大豆根中，当类似真菌的病原体Phytophthora sojae侵袭时miR393和miR166被诱导并参与到PTI过程。尽管许多miRNA被诱导去抑制植物防御的负调控因子，但有些miRNAs也会被下调以帮助植物抵抗病原体。在拟南芥中，miR398b和miR773被flg22下调，以增加胼胝质的沉积及植物对细菌的抵抗力。当细菌和真菌感染后，miR400被下调，导致PENTATRICOPEPTIDEREPEAT1/2基因的表达增强，这两个基因均编码定位于线粒体的五肽重复序列，并且可能通过控制ROS的代谢来促进PTI。在水稻中，miR164a被下调，其靶标转录因子OsNAC60被抑制，从而增强了植物对M. oryzae的防御反应。
病原体通过将效应蛋白传递到植物细胞中来对抗PTI。为了抵抗病原体的入侵，植物细胞利用R蛋白识别效应蛋白并启动具有更强触发-效应的免疫（ETI）。与结合AGO1并参与PTI的miR393不同，miR393 *是由无毒性P. syringae pv. TomatoDC3000携带的效应子avrRpt2诱导的。这种miRNA优先加载到AGO2中，并通过抑制MEMB12的表达来促进抗菌性PATHOGENESIS-RELATEDPROTEIN的分泌，从而促进ETI。MEMB12是定位于高尔基体的SOLUBLENETHYLMALEIMIDESENSITIVE FACTOR ATTACHMENT PROTEIN RECEPTOR蛋白。类似地，miR863-3p被DC3000表达的avrRpt2诱导，并且帮助PATHOGENESIS-RELATED PROTEIN蛋白分泌的增加，尽管其与AGO1结合并抑制ATYPICAL RECEPTOR-LIKEPSEUDOKINASE 1和2，但能能达到促进ETI的效果。在大麦中，miR398-CSD1模块可以促进R基因MILDEW RESISTANCE LOCUS A（MLA）-介导的ETI。大麦在被大麦白粉病真菌感染后，MLA的激活可以下调miR398以抑制其靶基因CSD1的表达，从而增加CSD1-介导的ROS积累和细胞死亡。
但是，R蛋白引发的ETI对植物具有适应性代价，因此在没有病原体侵袭的情况下ETI被阻止且在防御后被减弱。一组miRNA靶向R基因的转录本并触发phasiRNA的产生，从而在没有病原体感染的情况下防止R蛋白引发自身免疫（图3）。最初发现，苜蓿中具有22个核苷酸的miRNAs（miR2118、miR1507和miR2109）可以靶向并切割nucleotide binding andleucine-rich repeat (NB-LRR)基因（最大的一组植物R基因）的mRNA，并触发phasiRNA的产生。随后，已证明miRNA-介导的R基因表达调控是一种保守的机制。在烟草中miR6019/6020靶向TIR-NBLRRimmunereceptor N基因，在番茄中miR482/miR2118/miR5300靶向具有卷曲螺旋结构域的NB-LRRs，在大麦中miR9863靶向MLA是等位基因。当病原体感染后，病原体衍生出的效应蛋白会抑制这些miRNAs-介导的沉默级联反应，同时激活ETI。植物防御后，这些miRNAs受到抑制，R基因又被抑制以防止过度免疫（图3）。有趣的是，这些miRNA-R基因模块与年龄相关的ETI有关。番茄和烟草生长过程中R基因表达的全基因组提高与R基因相关的小RNA（sRNAs）（包括miRNA和phasiRNA）的减少有关。由于miR6019/6020的逐渐减少和NB-LRRs表达的增加，成熟植物对烟草花叶病毒的抵抗力也逐渐增强。
图3. miRNA-介导的R基因调控。一组22个核苷酸的miRNAs可以靶向R基因并触发phasiRNA的产生，从而增强许多植物中R基因的沉默。（a）在没有病原体的情况下或在免疫的后期，这些miRNA-R基因模块被激活从而防止自身免疫或过度诱导的免疫，而这两种情况都对植物具有适应性代价。（b）在病原体感染后，由于病原体效应蛋白的作用，这些22-nt miRNAs介导的沉默被抑制，从而激活R基因以引发效应蛋白-触发的免疫反应。
抗病毒免疫：与细菌和真菌感染相似，病毒感染也会引起miRNAs水平或活性的改变，这通常与RNA沉默途径组分的诱导有关。当水稻条纹病毒（RSV）感染水稻时，多种miRNAs（包括miR535、miR390和miR171以及部分OsDCL和OsAGO）被诱导。miR393和选定的水稻RNA-依赖性的RNA聚合酶均被水稻矮缩病毒诱导。在另一项研究中，当RSV感染水稻，单子叶植物特异性的miR444被诱导出来，并通过靶向3种 MIKCC-型MADS盒蛋白来减缓RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE1的转录抑制，从而提高抗病毒siRNAs的产量和病毒抗性。水稻AGO18是一种缺乏切割的AGO蛋白，可被RSV诱导，然后结合并隔离miR168，从而释放其靶蛋白AGO1，从而赋予植物广谱性的病毒抗性。除了影响RNA沉默途径组分的表达外，miRNA水平或活性的改变也可能会调节其它细胞过程，并有助于植物防御病毒。例如，在RSV感染后，单子叶植物特异的miR528被AGO18隔离，导致其靶标蛋白L-ASCORBATE OXIDASE的抑制被减轻。抗坏血酸氧化酶水平的升高会增加ROS的积累并增强抗病毒防御能力。
抗昆虫免疫力：在拟南芥中，miR156-SPL9模块可正向调节植物对棉铃虫的抗性。幼年期高水平的miR156抑制了SPL9（miR156的靶标）。而SPL9保护茉莉酸信号通路的阻遏物JASMONATE-ZIM DOMAIN蛋白3不被降解，SPL9的抑制激活了茉莉酸信号通路并增强了植物对昆虫的防御力。在Nicotiana attenuate中，AGO8对植物抗Manducasexta幼虫十分重要，并且可能调控与miRNAs有关的M. sexta幼虫抗性。在黄瓜中，多种miRNA-靶标模块通过抑制植物生长素信号传导途径来介导对蚜虫的抗性。
基因表达的跨种调控：有趣的是，植物利用miRNA途径来增强自身免疫力，并将其miRNAs输入到某些病原体中，以沉默具有重要毒性的效应因子并削弱病原体。当棉花大丽轮枝菌感染拟南芥和棉花时，miR166和miR159分别被诱导并输入到真菌菌丝中，从而分别抑制Ca2 +依赖性的CYSTEINE PROTEASE-1和ISOTRICHODERMIN C-15 HYDROXYLASE的表达，这两种基因的大丽轮枝菌敲除株毒力减弱且无法引起枯萎病。sRNA（包括miRNAs）的输出，最近被发现是由植物胞外液泡的分泌物（可以被真菌细胞吸收）完成的。
MicroRNA在共生过程中的生物学功能
为了应对营养匮乏，豆科植物与土壤根瘤菌和丛枝菌根真菌建立了共生互作，分别促进了固氮根瘤和菌根丛枝的形成。固氮根瘤有益于植物，将游离的氮转化为生物学上可利用的氮，而菌根丛枝有助于植物有效吸收矿质养分。这些结构的形成包含一系列复杂的细胞重编程事件。miRNA-介导的对共生相关的基因或生长素信号传导的调节为精细调控重编程事件提供了额外的控制保障。
共生相关基因：一个复杂的信号网络控制着根瘤。NOD FACTOR-介导的信号传导通路促进了根瘤的形成，而AUTOREGULATION OFNODULATION (AON)信号-介导的负反馈系统可防止根瘤耗能过多。miR169首先被确定参与了根瘤的过程。miR169靶向HAP2 MtHAP2-1的紫花苜蓿同源基因，其编码共生特异性的转录因子，并在空间上将MtHAP2-1的mRNA转移至根瘤的分生组织区域。这对于根瘤细胞的分化至关重要，因为表达抗-miR169 的MtHAP2-1转基因植物出现了损害根瘤生长的现象。感染了根瘤菌后会诱导出miR172，它可正调节大豆、Lotusjaponicus和普通黄豆中的根瘤。在大豆结瘤形成过程中，miR172的诱导会抑制其靶标NODULENUMBER CONTROL 1（早期结节蛋白基因ENOD40的转录阻遏物），并抑制ENOD40的表达，从而促进根瘤的形成。防止根瘤过度生长的AON信号传导可以抑制miR172表达。因此，miR172–NODULE NUMBER CONTROL 1调节模块代表了NOD因子与AON信号通路之间的联系，并有助于确定豆科植物中的根瘤数。防止根瘤过度形成还可以通过诱导miR171来实现。在L. japonicus中根瘤和苜蓿中丛枝菌根的共生期间，miR171被诱导从而抑制NODULATIONSIGNALING PATHWAY 2，其编码结节形成所需的植物特异性GRAS基因家族成员。通过下调NSP2，miR171的诱导可以防止由菌根真菌引起的过度根瘤或过度定殖根。此外，通过结瘤诱导的miR393j-3p直接靶向并抑制大豆中另一个结瘤基因ENOD93，从而防止过度结瘤。与上述miRNAs的情况相反，在苜蓿中，miR396a响应菌根真菌的感染而出现表达降低。这个过程伴随着其靶标基因GRF4的表达增加。miR396的失活促进菌根真菌的根部定殖，而其过表达则会抑制这一过程，表明miR396充当着菌根丛枝形成的负调节剂。
生长素信号传导：转录后的miRNA抑制生长素受体TIR1/AFB家族和多种ARF的表达。miRNA水平被精细调控以决定在结节发育的不同阶段以及在不同的结节组织中特定生长素的敏感性。在大豆中，miR160和miR167（分别靶向阻遏物ARF10/16/17和激活剂ARF8）充当生长素敏感性的正调节剂和负调节剂。在结节发育早期，低的植物生长素敏感性促进结节原基的形成。为了在此阶段实现低的植物生长素敏感性，miR167被诱导的同时，miR160的水平保持在较低水平。miR160的过表达或miR167的抑制会增加植物生长素的敏感性，从而使结节的形成明显减少。然而，在结节成熟期间，更倾向于高生长素敏感性，并且结节通过积累高水平的miR160来确保其成熟。miR393d-TIR1/AFB3模块负调节大豆根瘤的发育。miR393d在结节组织中的特异性表达决定了不同结节组织中TIR1/AFB3的表达水平和植物生长素敏感性。
根据顶端分生组织的持久性，豆类结节可分为两类：确定的（例如在大豆，L. japonicus）和不确定的（例如在紫花苜蓿、豌豆中）。两项研究表明，miRNA可能决定生长素敏感性的差异，并对不同类型结节的形成产生不同的影响。 miR390通过靶向TAS3 mRNA来调节植物生长素的敏感性，并引发次级siRNAs（即反式siRNA（tasiR）-ARFs）的产生，该次级siRNA可以裂解ARF2/3/4的mRNA。 miR390-TAS3-ARFs模块的基因损坏增加了生长素的敏感性，促进了紫花苜蓿的根瘤菌感染和结瘤。然而，由于REL3（tasiR-ARF生物形成中涉及的关键成分）的损耗，L. japonicus 中tasiR-ARF的产生被中断会导致植物生长素转运的敏感性增加，但降低植物生长素的敏感性并抑制结节。菌根丛枝的形成可能需要高的生长素敏感性。在番茄、苜蓿和水稻的菌根形成期间，miR393被下调，其靶标编码TIR1/AFB生长素受体的基因被上调（图2），而miR393的过表达会导致菌根丛枝不发育。
MicroRNA在寄生过程中的生物学功能
要建立寄生作用，寄生植物或蠕虫会形成特殊的进食器官从寄主植物中汲取养分。多种miRNAs参与到该过程中。在拟南芥中，miR827和miR396有助于合胞体（是由寄生性囊肿线虫诱导产生的进食结构）的形成。在合胞体初始诱导和发育过程中，miR827被剧烈上调，通过抑制其靶标NLA基因（编码在激活免疫系统中起作用的泛素E3连接酶）来抑制宿主植物的基础防御。同时，miR396被下调以抑制其靶标基因GRF1/3的表达，该靶基因编码合胞体基因表达和合胞体形成的正向调节剂。在拟南芥中，miR390和miR159促进瘿瘤的形成，瘿瘤是根结线虫与植物之间寄生互作的另一种进食器官。在瘿瘤形成过程中，高水平的miR390积累，引发了TAS3-衍生物tasiRNAs的产生，从而使ARF3沉默，导致生长素信号转导受阻（图2）。在TAS3突变体中TAS3-衍生物tasiRNAs的下调显着减少了瘿瘤的形成数量，这表明miR390-TAS3-ARF3模块对于瘿瘤形成至关重要。miR159在瘿瘤发育过程中逐渐积累，并限制了其靶标基因MYB33的表达。敲除miR159abc的突变株对根结线虫的敏感性较低，表明miR159促进瘿瘤的发育。
宿主miRNAs不仅用于建立寄生，而且宿主植物也从寄生植物中接收miRNAs从而促进寄生性。 寄生植物Cuscuta campestris传递一系列22-nt miRNAs来寄生拟南芥，引发吸器（植物与植物之间寄生互作的觅食结构）中次级siRNA的产生。许多靶标与植物的发病机理有关，表明这些C. campestris miRNA可能作为致病因子来重塑宿主的基因表达并促进这种寄生相互作用的建立。
评论
MicroRNA（miRNA）是一类内源性小非编码RNA，会对基因表达产生负调控。它们是通过多个步骤产生的，包括转录、前体加工、甲基化以及miRNA诱导的沉默复合物（miRISC）的组装。本文作者回顾并讨论对植物miRNA生物形成和调控作用、miRNAs在植物发育可塑性的作用、非生物/生物响应以及共生/寄生互作中调控作用的理解，同时根据目前的研究现状，提出了植物miRNA未来研究方向的建议，同时帮助植物miRNA相关研究工作者全面及时地掌握该领域的研究现状！
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