科研 | J Exp Med：转录组揭示PRDM16抑制肾癌中HIF靶向基因的表达
编译：阿温，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：PRDM16 suppresses HIF-targeted gene expression in kidney cancer
译名：PRDM16抑制肾癌中HIF靶向基因的表达
期刊：The journal of experimental medicine
IF：10.892
发表时间：2020.6.1
通讯作者：Sunil Sudarshan
通讯作者单位：阿拉巴马大学伯明翰分校
DOI号：10.1084/jem.20191005
实验设计
结果
1. PRDM16在RCC中呈表观遗传沉默
作者最近报道了肾癌DNA甲基化和基因表达的整合基因组分析，包括三个样本组：正常肾(n = 9)、原发性RCC(n = 9)和转移性RCC(n = 26)。使用GEO2R分析了GSE105261的转录组数据，并且基于F统计量确认了前250个差异表达基因，F统计量是当存在两个以上的样本组时，结合所有两两比较的t统计的分析。先前描述的RCC中表达改变的基因在此数据集中也发生了改变，包括SFRP1(与正常相比，肿瘤中表达减少)和NDUFA4L2(与正常相比，肿瘤中表达增加)。基于F统计量的排序，作者注意到PRDM16是该数据集中差异表达最显著的基因，随着肿瘤的发展，表达减少(图S1A)。PRDM16编码转录因子PRDM16。PRDM16在棕色脂肪组织的生理机能中有突出的作用。与之前在小鼠组织中的研究一致，作者在棕色脂肪组织中发现了PRDM16的表达要相对白色脂肪组织中表达较低(图1A)。在组织中，PRDM16最高表达于肾脏，心脏和小肠。与这些数据一致的是，人类组织的转录组分析也显示PRDM16在肾脏中表达相对较高(图S1B)。此外，作者在一组RCC细胞系中观察到PRDM16 mRNA降低，相对于未转化的肾上皮细胞RPTEC(肾近端小管上皮细胞) (图S1C)。与mRNA数据一致的是，患者相应样本的免疫印迹也显示肿瘤中PRDM16蛋白表达降低(图1C)。此外，正常肾脏的免疫组化染色显示，核PRDM16在肾近端小管上皮中表达，这是ccRCC的细胞来源(图1D和图S1D)。相比之下，在ccRCC肿瘤细胞中未检测到PRDM16的表达。PRDM16是包含PR结构域的家族成员之一。因此，作者使用UALCAN分析门户检测了TCGA数据库中PRDM16和其他含有PR结构域的家族成员的相对表达。TCGA中RNA测序(RNaseq)的数据分析表明，在ccRCC中PRDM16的表达显著减少(图1E)。作者还分析了来自美国国家癌症研究所(NCI)赞助的临床蛋白质组肿瘤分析联盟的关于透明细胞肾癌的蛋白质组数据，这些数据最近使用UALCAN分析门户网站进行了报道。这些数据清楚地显示了RCC中PRDM16蛋白的减少，因此验证了作者免疫印迹和免疫组织化学的分析(图1F)。与PRDM16的显著下调相比，RCC中PRDM2和PRDM4的表达只出现了适度的下调(约1.3倍) (图S1E)。值得注意的是，在肿瘤样本中，PRDM16的低表达与预后恶化相关(图1G)。然而PRDM2或PRDM4与结果无相关性。
RCC组织和细胞系中PRDM16的强烈下调促使作者考虑其沉默的可能机制。ccRCC中最常见的肿瘤引发事件是VHL基因的改变。VHL功能的丧失导致HIFs的异常稳定。TCGA数据分析表明，与正常肾脏相比，VHL突变体和WT ccRCC中的PRDM16都是沉默的(图1H)。先前的研究表明，PRDM家族成员在癌症中可能受表观遗传调控。因此作者评估DNA甲基化后是否促进PRDM16沉默。首先分析了TCGA数据库中肿瘤样本的甲基化和基因表达数据。基于UCSC基因组浏览器的分析，在PRDM16转录起始位点周围有三个富含CpG的区域(图1I)。鉴定了该区域的10个CpG位点，其甲基化与PRDM16 mRNA表达之间的反相关性最强。这些位点中有一半(包括反相关性最密切的四个地点)位于PRDM16上游的CpG区域(黄色所示，图1I和图S2 A)。CpG位点甲基化与CpG位点(cg01514538) PRDM16 mRNA表达呈最强的负相关性，如图1J所示。TCGA甲基化组的数据是通过标准亚硫酸氢盐测序得到的，无法在5-甲基半胱氨酸(5mC)和5-羟甲基半胱氨酸(5hmC)之间分解。虽然基因启动子中5mC的积累与沉默有关，但5hmC的积累已被证明在增强子区域积累，并可能与表达增加有关。因此，作者通过染色质免疫沉淀-定量PCR (ChIP-qPCR)来评估岛上CpG位点的DNA 5mC水平，该方法使用了一种针对5mC的抗体。我们发现在RCC细胞株RXF-393和RCC4中，cg01514538区域内显著富集了5mC(图1K)。此外，在多个患者匹配的样本中，肿瘤包含CpG位点的多个区域(cg05346286、cg03969902和cg01514538)的5mC水平高于正常肾脏(图1L)。作为阳性对照，发现RCC中ESSRG启动子的5mC富集增加(与匹配的正常肾脏相比)，作者最近报道了该基因在RCC中的甲基化(图S2B-C)。总的来说，这些数据表明在RCC中PRDM16的启动子区域被甲基化。TCGA数据分析显示，PRDM16在其他肿瘤(如启动子甲基化的肺腺癌)中的表达降低(图S2D-F)。
2. PRDM16在体外和异种移植小鼠模型中降低RCC细胞的生长
RCC中PRDM16的甲基化和沉默促使作者考虑这一发现的生物学意义。如前所述，PRDM16在棕色脂肪代谢中有重要作用，被认为可以诱导脂肪细胞线粒体代谢相关转录因子的表达，包括PGC-1α、ERR-γ以及UCP1。值得注意的是，在RCC中PPARGC1A和ESRRG的表达降低。因此，我们通过RCC细胞的稳定转导，评估了RCC细胞中PRDM16对这些因子表达的影响。免疫印迹显示，转导后的PRDM16蛋白表达水平与正常肾脏相当(图2A)。在检测的多个RCC细胞系中，PRDM16的异位表达与这些因子的表达表现出不一致的影响(图2B)。根据这些数据，作者没有观察到氧消耗的增加(图2C)。先前的研究表明，佛司可林和罗格列酮等药物可以增强小鼠棕色脂肪细胞中PRDM16的功能。两种药物都能在多种细胞中促进PRDM16诱导ESRRG(图S3A-B)。然而，观察到在PPARGC1A或UCP1的表达或氧消耗方面没有一致的影响(图S3A-C)。确实观察到修复PRDM16可以抑制OSRC-2细胞的增殖，在Caki-1和786-O细胞中抑制作用较小(图2D-F)。此外，PRDM16还减少了RCC细胞的迁移、伤口愈合和体外侵袭(图S4A-C)。这些数据促使作者评估PRDM16对体内肿瘤生长的影响。在OSRC-2和Caki-1细胞中，PRDM16表达的恢复明显抑制了RCC异种移植瘤的生长(图2G-H)。
3. PRDM16在RCC中主要抑制转录
作者观察到PRDM16可以抑制体外增殖和体内肿瘤生长，尽管缺乏PPARGC1A和ESRRG的诱导(在没有罗格列酮和佛司可林的基础条件下)使作者考虑在细胞代谢的既定作用之外是否存在PRDM16的影响。对786-O细胞加或减PRDM16的外源性表达进行RNaseq分析。分析表明，PRDM16对转录景观有抑制作用(图3A-B)。在PRDM16表达修复后，发生改变的基因中三分之二的基因下调，而只有三分之一的基因上调。通路分析显示，PRDM16抑制参与轴突引导和信号传导的基因表达，包括跨膜蛋白semaphorin (SEMA)家族的成员(图3B-C)。SEMAs是一类信号分子，其功能主要在神经系统中。SEMAs与它们的受体plexins结合，plexins结合并激活酪氨酸激酶。值得注意的是，在最初的GEO2R分析中，RCC中增加的SEMA5B也被确定为差异表达基因(图S5A)。作者评估了TCGA数据库ccRCC中PRDM16抑制的SEMA家族成员的相对表达，发现SEMA5B在ccRCC中表达最高(图3D)。此外，TCGA中所有肿瘤类型的数据分析表明，SEMA5B在ccRCC中表达最高，在其他所有组织中，无论良性或恶性(图3E)。RT-qPCR分析ccRCC患者的肿瘤/正常配对，证实SEMA5B增加(图3F)。验证了PRDM16对OSRC-2和RXF-393 RCC细胞中SEMA5B的抑制作用(图3G)。此外，在体内验证了这一发现，与对照组相比，表达PRDM16的异种移植瘤中SEMA5B的mRNA表达较低(图3H)。
4. SEMA5B是HIF靶基因
SEMA5B在ccRCC中高表达，使作者考虑是否VHL在调控SEMA5B表达方面有一定作用。首先通过RT-qPCR分析SEMA5B mRNA的表达，观察到VHL WT细胞系中SEMA5B的表达较低。VHL突变株具有可变表达(图4A)。因此，作者将SEMA5B的表达作为VHL在配对表达或沉默VHL的RCC细胞系(786-O和RCC4)中表达的函数进行研究。亲本RCC4细胞表达HIF-1α和HIF-2α，而亲本786-0细胞只表达HIF-2α。由于VHL可促进HIF的降解，VHL重组会导致RCC4和786-O细胞中HIF靶基因GLUT1的表达降低(图4B)。RCC4细胞中VHL修复会导致PDK1基因表达降低，PDK1是一个已知的HIF-1α靶基因(图4B)。在HIF-1α不表达的786-O细胞中，恢复VHL基因对这些细胞中PDK1的表达没有影响。VHL的恢复导致SEMA5B mRNA显著降低(图4C)。与VHL对HIF调节的作用一致，OSRC-2细胞中VHL的恢复导致了HIF-1α和HIF-2α蛋白表达降低(图4D)。与转录组数据一致，修复VHL也导致SEMA5B蛋白表达减少(图4D和S5D-E)。为了进一步证明HIF在SEMA5B调控中的作用，作者检测了缺氧环境下二甲基草酰甘氨酸(DMOG)和CoCl2在表达VHL的RCC细胞(RCC4/VHL和Caki-1)中的作用。DMOG和CoCl2促进HIF靶基因(GLUT1和PDK1)以及SEMA5B的诱导(图4E-F)。SEMA5B在缺氧环境下显著诱导其表达，使作者考虑体内相对缺氧的环境是否也能诱导SEMA5B表达。因此，作者检测了正常HIF靶基因(图4G)和SEMA5B(图4H)在体内生长的Caki-1细胞中的表达，并与在标准体外培养条件下生长的细胞进行比较。Caki-1细胞为VHL WT细胞，因此在正常氧环境下不显示增加HIF蛋白的表达。虽然观察到PDK1和GLUT1的表达在体内显著增加(图4G)，但发现SEMA5B在体内的表达相对于体外增加了40多倍(图4H)。接下来确定PRDM16是否可以抑制HIF介导的SEMA5B表达。与亲代细胞一致，DMOG处理经对照载体稳定转导的Caki-1细胞后，SEMA5B的表达显著增加。然而，PRDM16的表达减弱了DMOG诱导SEMA5B的能力(图4I)，而没有减弱其他HIF靶基因的诱导能力(图4J)。
5. SEMA5B在体内和体外均促进RCC生长
接下来，评估了SEMA5B在RCC细胞中表达升高的生物学意义。先前关于RCC中SEMA5B增加的功能意义的研究范围有限。因此，作者通过在OS-RC-2细胞系中引入两种不同非重叠结构的shRNA来稳定敲低SEMA5B的表达。作者通过qPCR和免疫印迹技术证实目的基因的敲低(图5A)。与对照细胞相比，这两种稳定细胞系的克隆均显示增殖减少(图5B)。在RCC4细胞中也得到了类似的结果(图5C-D)。接下来，在未转化的HK2肾上皮细胞中表达SEMA5B(血凝素[HA]标记)而进行功能分析。免疫印迹法检测SEMA5B的表达(图5E)。SEMA5B表达的增加促进了HK2细胞的增殖(图5F)。当SEMA5B在769-P细胞中表达时也得到了类似的结果(图S5B-C)。基于这些数据，作者研究了SEMA5B在体内的作用。值得注意的是，作者发现SEMA5B基因敲除后显著降低了OSRC-2异种移植瘤的生长(图5G)。作者还研究了SEMA5B在完整VHL但HIF激活情况下的功能意义。VHL WT Caki-1细胞在缺氧条件、DMOG存在下进行培养，导致SEMA5B和GLUT1表达增加(图5H)。正如所料，SEMA5B shRNA降低了SEMA5B的表达，但没有影响GLUT1的表达(图5H)。在用DMOG培养的细胞中，敲低SEMA5B导致增殖减弱(图5I)。相反，敲低SEMA5B对SEMA5B低表达的细胞的增殖没有影响。
6. PRDM16与CtBP相互作用抑制了SEMA5B表达和RCC细胞生长
考虑到SEMA5B在促进RCC增殖和体内肿瘤生长方面的功能意义，接下来研究了PRDM16抑制SEMA5B表达的机制。先前的研究表明，PRDM16对转录的影响，无论是促进还是抑制，部分是由相互作用的蛋白质介导的。如前所述，PRDM16在肾脏中高表达，但其功能尚未明确。为了深入了解PRDM16在肾脏中的生物学特性，作者评估HEK293T细胞中与PRDM16相互作用的蛋白质。作者选择这细胞是因为它的来源是肾脏。作者在这些细胞中体外表达一个N端标记Flag的PRDM16，然后用Flag抗体和IgG抗体进行细胞裂解液的免疫沉淀(IP)。免疫沉淀组分先进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后用胰蛋白酶进行凝胶酶解，最后利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行分析。值得注意的是，CtBP-1/2是富集最多的蛋白质之一。先前的研究表明，PRDM16与辅助抑制因子CtBPs的相互作用对抑制棕色脂肪组织中的白色脂肪基因表达程序至关重要。通过HEK293T和OSRC细胞的免疫沉淀证实了这种相互作用(图6A-B)。先前的研究发现，PRDM16与CtBP1和CtBP2的相互作用依赖于PRDM16序列中的PLDLS序列(氨基酸804-808)。PLDLS序列突变为PLASS断裂了脂肪细胞中PRDM16/CtBP的相互作用。与这些数据一致的是，PRDM16中PLDLS序列的突变破坏了HEK293T和OS-RC-2细胞中与CtBP的相互作用(图6A-B)。两种细胞系的免疫印迹表明突变对CtBP蛋白表达均无显著影响。作者接下来检测了WT和突变PRDM16抑制SEMA5B mRNA和蛋白表达的能力(图6C-D)。与之前的数据一致，WT PRDM16显著降低SEMA5B的表达，而PRDM16突变体对SEMA5B无影响。使用UCSC基因组数据库对DNA元件百科全书(Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE)的ChIP测序(ChIP-seq)进行分析，发现在SEMA5B转录起始位点的2 kb范围内存在CtBP结合位点(图6E)。因此，作者通过ChIP-qPCR评估PRDM16或CtBP是否与该区域结合。WT和突变体PRDM16与该区域的结合与IgG对照组相似。相反，与WT PRDM16相比，在表达突变PRDM16的RCC细胞中，CtBP与该区域的结合显著减少(图6F)。总的来说，这些数据表明CtBPs与PRDM16的相互作用促进CtBPs与SEMA5B启动子的结合。
基于这些数据，评估了PRDM16与CtBPs的相互作用是否对肿瘤表型的影响至关重要。与对照细胞相比，WT PRDM16转导的RCC细胞的增殖减少，而突变PRDM16转导的RCC细胞的增殖没有减少(图6G)。此外，与WT PRDM16表达细胞相比，PRDM16突变转导的细胞在体内易于生长，这表明肿瘤生长显著降低(图6H)。接下来，作者评估了PRDM16抑制SEMA5B表达的功能意义。因此，除了空载和单独的PRDM16，作者还同时表达PRDM16和SEMA5B(图6I)。表达PRDM16的OSRC-2 RCC细胞显示SEMA5B减少，增殖和集落形成减少(图6J-K)。然而，同时表达SEMA5B的细胞可以部分地挽救PRDM16对增殖和菌落形成的影响(图6J-K)。这些数据表明，PRDM16的影响至少部分依赖于SEMA5B。总的来说，这些数据表明PRDM16可以拮抗肾细胞癌中HIF/SEMA5B轴的增殖作用。此外，这些数据表明，PRDM16对HIF/SEMA5B轴和肿瘤生长的影响取决于其与CtBPs的相互作用。如图7所示，数据既与低氧VHL WT肿瘤相关，也与非低氧VHL突变肿瘤相关。
结论
总之，研究数据显示了沉默PRDM16在ccRCC中的作用。研究表明，PRDM16参与了调节HIF介导的SEMA5B表达。这些数据为表观遗传学在ccRCC中调控HIF信号方面的作用提供了新见解。此外，它们还为HIF-SEMA5B轴驱动的肿瘤的治疗干预提供了新的研究方向。
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