检验分析中对可溶性ST2 和半乳糖凝集素3的认识
摘 要：蛋白质可溶性ST2（sST2）和半乳糖凝集素3作为心脏疾病的备选生物标志物越来越引起人们的兴趣。2013 AACF/AHA指南将这二者作为急性和慢性心衰患者的附加风险分层生物标志物。本文的目的是提供关于循环sST2和半乳糖凝集素3测量的分析考虑的信息，包括这两种生物标志物的体外稳定性、生物学变化和参考范围。
简 介：蛋白质可溶性ST2（sST2）和半乳糖凝集素3作为心脏疾病的备选生物标志物越来越引起人们的兴趣。越来越多的证据表明这2种分析物的血浆浓度能独立作为生物标志物或附加于其他现有标志物如心肌肌钙蛋白或钠尿肽提供心脏疾病患者的预后信息。2013 AACF/AHA指南将sST2和半乳糖凝集素3都作为急性和慢性心衰患者附加的风险分层生物标志物。
蛋白质sST2（也被称为类白介素1受体，B亚型），是一种长度为328氨基酸，分子量为36993Da的蛋白质，该蛋白质在一些位置被糖基化。蛋白质半乳糖凝集素3（也被称为Mac-2抗原或碳水化合物结合蛋白35）是一种长度为250个氨基酸，分子量为26152Da的蛋白质，可以形成二聚体或更高阶的低聚物。
本文的目的是提供关于循环sST2和半乳糖凝集素3测量的分析考虑的信息，包括这两种生物标志物的体外稳定性、生物学变化和参考范围。
sST2和半乳糖凝集素3的病理生理学
ST2是具有横跨膜的（ST2L）白介素1受体家族成员，亚型可溶（sST2）。ST2L是一种膜结合受体，白介素33（IL-33）是ST2L的功能性配合基。原则上，IL-33的动能是作为危险信号或警告素，在发生病原体暴露、伤害诱导应激或坏死死亡后向所在区域的免疫细胞发出存在组织损伤的信号。IL-33/ST2L信号导致炎症基因转录并最终导致炎症细胞因子/趋化因子的形成和免疫反应感应。sST2是ST2的一种被删减的可溶形式，sST2被分泌到循环中，作为IL-33的“欺骗”受体，抑制IL-33/ST2L信号的效果。因此，循环中sST2的浓度升高会削弱IL-33的全身生物学效果。sST2的血液浓度显著上升，表示出现炎症或传染病、癌症以及非慢性肾病条件下的心脏疾病。但是健康个体和明显患病患者（尤其是心脏疾病）的主要循环sST2来源目前仍然不明。
半乳糖凝集素3是嵌合体型半乳凝素的唯一成员，参与大量的疾病过程。半乳糖凝集素3包含碳水化合物识别结合域，能针对性结合β半乳糖苷。半乳糖凝集素3同时具有细胞内和细胞外功能，具有独立浓缩能力形成单体或低聚物。半乳糖凝集素3参与细胞粘附、活化、增殖、凋亡以及迁移。它不仅在癌症，还在炎症中发挥重要作用。在本文中，半乳糖凝集素3作为一种从急性炎症到慢性炎症再到组织纤维蛋白形成等数个阶段连续发挥作用的调节蛋白被评估。实际上，半乳糖凝集素3参与多种“炎症/纤维化”疾病如关节炎、哮喘、肺炎、动脉粥样硬化和肾病。即使在心衰病理生理学中，半乳糖凝集素3也在从炎症到纤维化的过程中发挥着生物作用。
测量循环sST2和半乳糖凝集素3的试验
表1列出的是选定的人血清/血浆sST2半乳糖凝集素3测量的多种商购试验。
在表1的ST2试验中，Presage ST2试验（Critical Diagnostics）是美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准并获得CE标识的试验；这是一种酶联免疫吸附试验（ELISA）。而且，Presage ST2试验的制造商最近开始推出的ASPECT-PLUS ST2试验（定量三明治单克隆免疫层析试验）是一种测量sST2的POC定量试验。将来在自动化平台上执行sST2测量试验将成为可能。和FDA批准的Presage试验相反，MBL ST2 ELISA、RayBiotech ST2 ELISA 和R&D ELISA是研究用试验。
第一种获得FDA批准和CE标识的半乳糖凝集素3测量试验是BGM半乳糖凝集素3 ELSIA（BG Medicine）。之后，雅培和bioMérieux和BG Medicine达成合作将该试验商业化用于其自身的自动化平台。同时，ARCHITECT半乳糖凝集素3试验（雅培诊断）最近也已经获得了FDA批准和CE标识。ARCHITECT半乳糖凝集素3试验使用酶联发光试验技术。而R&D半乳糖凝集素3试验是一种ELISA形式的研究用试验。
在本文中，我们首先叙述Presage ST2试验和BGM半乳糖凝集素3试验的分析性能，随后将其与其他sST2和半乳糖凝集素3测量方法进行比较，讨论这两个试验的特点。
Presage ST2 试验
试验形式
Presage ST2试验是一种体外诊断设备，能通过ELSIA定量测量血清和血浆中的sST2。Presage试验的试剂盒位于微孔板结构内。试验使用小鼠单克隆抗人sST2捕获和检测抗体。实时测试证明在2-8℃储存时，Presage ST2试验的寿命为12个月。已经确认血清、锂肝素血浆EDTA血浆为Presage ST2试验可能的样品类型。
精密度、线性、检测限和定量限
使用稀释到1:50的标本时，标准的范围是3.1-200.0ng/ml。制造商标称的空白限（LoB）为0.5ng/ml，检测限（LoD）为1.3ng/ml，定量限（LoQ）为2.4ng/ml。在2个发表的研究中，发现了<0.20ng/ml的检测限（LoD）。Presage ST2试验的批内变异系数（CV）为<2.5%，其中一项研究的总CV为<4.0%；另一项研究的日内CV为<7.6%，总CV为<14%。线性分析的结果表明该试验在试验校准曲线的动态范围内具有线性。溶血、脂血、黄疸和类风湿因子导致的影响很小。
体外分析物稳定性
sST2的体外稳定性研究结果表明室温下分析物保持稳定48小时，4℃时分析物保持稳定至少7天，-20℃和-80℃时保持稳定性至少1.5年。因此，使用Presage ST2试验测量的分析物完全适合实验室日常使用，样品运输和储存也没有问题。3次冻融似乎不会影响分析物的浓度。
ST2的生物学变化
在为期6周，间隔为1周的研究中研究了血浆中值sST2浓度为10ng/ml（范围：5-34ng/ml）的健康个体的sST2生物成分变化，个体内生物学CV为11%，个体间生物学CV为46%，发现的参考变化值为30%。参考变化值表明2次sST2连续测量之间要求的差值P<0.05。在所有Presage ST2试验的研究中，在为期8周的研究中，每隔2周对中值血浆sST2浓度为29ng/ml（范围：12-75ng/ml）的个体进行采血时，作者揭示了类似的生物学成分变化，获得了完全相同的结果。30%的参考变化范围可能是未来的研究证明sST2可用于一段时间内治疗结果监测的基础。
参考值研究内的sST2浓度
从欧洲健康成人献血者的参考值研究中，可以很明显地发现使用Presage ST2试验测量sST2时性别特异性参考值的必要性。性别之间存在显著的血浆浓度差异：男性样品中，sST2的参考区间为4-31ng/ml，但是女性样品的参考区间为2-21ng/ml。另一项基于美国人群的评估揭示的男性和女性成人的参考区间略高，但是性别之间的区别仍然显著；男性样品中，sST2的参考区间为9-50ng/ml，女性样品则为7-33ng/ml。最近，来自Framingham研究亚组的循环sST2的参考值再一次揭示了男性和女性个体间sST2浓度存在显著差异；男性样品中，sST2参考区间为11-45ng/ml，女性样品则为9-35ng/ml。
非心衰但患有肾病的儿科患者中，sST2血浆浓度与年龄、性别或体重指数无关；参考区间8-64ng/ml包括4个异常值，9-50ng/ml则排除了异常值。
图1. 3种不同方法获得的sST2血浆浓度散点图
（A）MBL试验vs.Presage试验；（B）R&D试验vs.MBL试验；（C）R&D试验vs.Presage试验。根据表2的Passing&Bablok，方法比较图显示为具有回归线（实线）和回归线95%置信区间（虚线）的散点图。此外，每个图给出斯皮尔曼等级相关的结果。分析了45名患有多种疾病的患者的样品。
Presage ST2试验与现有其他商购试验在sST2测量方面的比较
在发表的研究中，主要使用了3种不同的试验测定循环sST2浓度，这3种试验是Presage ST2试验、MBL ST2试验和R&D ST2试验。MBL ST2试验最初是由日本的Tominaga及其同事的研究小组开发的。
在先前发表的研究中，比较了使用这3种商购试验测量的sST2血浆浓度。使用Presage ST2试验研究参与者的血浆中值sST2浓度为43.5ng/ml，使用MBL ST2试验测量的浓度为0.375ng/ml，使用R&D ST2试验测量的浓度为0.144ng/ml。回归分析揭示这3种方法间存在主要的差异。该研究的结果总结在表2和图1的散点图中。使用Presage ST2试验获得的sST2浓度和使用MBL ST2试验以及R&D ST2试验获得的浓度不一致。这3种方法缺乏一致性可能是标准、抗体、试剂和缓冲液的不同所致。因此，注意到发表的研究中使用这3种方法获得结果不能直接比较非常重要。
目前，尚无发表的研究对使用ASPECT-PLUS试验和Presage ST2试验测量的sST2血浆浓度进行比较。我们仅能在ASPECT-PLUS试验的包装插页中找到相应的信息，包装插页显示了来自60个个体的EDTA血浆的一致信息。
相应的Passing-Bablok回归分析揭示了使用Presage试验作为参考方法的方程：
y [ng/mL] = 1.01 x +5.8 [ng/mL]
累积和试验（Cusum test）并未显示出其与线性存在明显偏差。
BGM 半乳糖凝集素3试验
试验形式
BGM半乳糖凝集素3试验是一种体外诊断设备，能通过ELISA定量测量半乳糖凝集素3。小鼠单克隆抗鼠半乳糖凝集素3抗体作为捕获抗体。小鼠和人半乳糖凝集素3半乳糖凝集素3之间的总体同源性为85%，在试验表位所在的蛋白N端，小鼠和人半乳糖凝集素3之间的同源性为100%。小鼠单克隆抗人半乳糖凝集素3抗体作为检测抗体。2-8℃时BGM半乳糖凝集素3试验试剂盒的寿命为27个月。已经确认血清和EDTA血浆为半乳糖凝集素3试验可能的样品类型。
精密度、线性、检测限和定量限
使用稀释为1:10的标本时，基于标准的测量范围是1.4-9.8ng/ml。制造商标称的空白限（LoB）为0.86ng/ml，检测限（LoD）为1.13ng/ml，定量限（LoQ）为1.32ng/ml。这些数据来自多中心评估研究。在相同的研究中，BGM半乳糖凝集素3的批内变异系数（CV）<7.4%，总变异系数<17%。证明BGM半乳糖凝集素3的线性位于试验校准曲线的动态范围内。未发现一般药物、脂血或黄疸的交叉反应性和干扰。
图2. 使用ARCHITECT半乳糖凝集素3和BGM半乳糖凝集素3试验获得的半乳糖凝集素3血浆浓度散点图
图A表示地点A i1000SR和ELISA的比较；
图B表示地点B i2000SR与ELISA的比较；
图C表示地点B i2000SR与ELISA的比较；
图D表示结合地点A和地点B的数据i2000SR与ELSIA的比较。
总计在地点A分析了190份样品，地点B分析了129份样品。灰色线表示x=y；黑色实现表示Passing-Bablok回归线。显示了回归线方程和相关系数。
图3. 使用VIDAS半乳糖凝集素3试验和BGM半乳糖凝集素3试验获得的半乳糖凝集素3血浆浓度散点图
使用VIDAS和BGM方法测量137名射血分数下降心衰患者获得的半乳糖凝集素3浓度。显示了Passing和Balok回归分析（A）和Bland和Altman描记图（B）。
“体外”分析物稳定性
发表试验评估研究的作者称室温下分析物保持稳定15天，4℃保持稳定15天，-20℃和-70℃至少保持稳定6个月。因此，BGM半乳糖凝集素3试验非常适于实验室日常测量该分析物，样品运输和储存也没有问题。6次冻融似乎不会影响半乳糖凝集素3分析物的浓度。
半乳糖凝集素3的生物学变化
在为期8周，以2周为间隔的研究中研究了半乳糖凝集素3中值为12ng/ml（范围：7-20ng/ml）的个体的半乳糖凝集素3生物学成分变化。个体内生物学变异系数（CV）为20%，个体间生物学CV为23%，参考变化值为61%。参考变化值表明要求2次半乳糖凝集素3连续测量的变化P<0.05。相同的研究中，作者揭示了对血浆半乳糖凝集素3浓度中值为12ng/ml（范围：6-28ng/ml）的个体进行为期4小时，每小时均采血的研究时，生物学成分变化的结果为：个体内生物学CV为16%，个体间生物学CV为39%。这2个参考变化值可能是未来研究证明半乳糖凝集素3可用于一段时间内治疗结果监测的基础。
参考值研究中的半乳糖凝集素3浓度
Biolmage研究中心脏疾病情况未知个体内测定的上限参考值为22ng/ml。全部个体具备可检测的半乳糖凝集素3水平，测量水平位于BGM半乳糖凝集素3试验的测量范围内。个体的年龄、性别或肾功能等因素没有对测量结果造成影响。
在非心衰但存在肾脏疾病的儿科患者中，半乳糖凝集素3血浆浓度与年龄、性别或体重指数无关；参考区间为7-44ng/ml包括2个异常值；7-33ng/ml的参考区间则排除了异常值。
BGM半乳糖凝集素3试验与现有其他商购试验在半乳糖凝集素3测量方面的比较
在绝大部分发表的临床研究中，使用了BGM半乳糖凝集素3试验（该试验之前的版本）；到目前为止，相对较少的研究使用了ARCHITECT半乳糖凝集素3试验、VIDAS半乳糖凝集素3试验或R&D半乳糖凝集素3试验。
ARCHITECT半乳糖凝集素3试验使用相同的单克隆抗体和BGM半乳糖凝集素3试验内使用的结合物。因此除了ARCHITECT半乳糖凝集素3试验在ARCHITECT i1000SR和ARCHITECT i2000SR平台上证明可接受的分析性能外，ARCHITECT半乳糖凝集素3试验（作为竞争方法）与BGM半乳糖凝集素3试验（作为参考方法）之间的方法比较揭示了1.0-1.2的斜率，<3.6ng/ml的截距和>0.90的相关系数。多中心试验比较详见图2。
根据我们的信息，根据BGM半乳糖凝集素3试验对VIDAS半乳糖凝集素3试验进行了标准化。但是由于所有权的原因，bioMérieux并未报告VIDAS试验采用的抗体的细节。但是其与BGM半乳糖凝集素3试验的比较研究显示出这两种方法之间具有可接受的相关性（相关系数0.90）和一致性，偏移也相当小（即斜率1.13；截距-3.83ng/ml），详见图3。
据我们所知，尚无发表的研究对R&D半乳糖凝集素3试验和BGM半乳糖凝集素3测量的半乳糖凝集素3血浆浓度进行了比较。但是如果我们正确地解析表1内的不同的检测限和测量范围，则我们可以假设这2种方法间的实际偏移（比例和/或恒定偏移）。
检验分析中尚不明确的内容
我们对ST2试验和半乳糖凝集素3试验之间的异同比较了解，在解析发表的文献的数据时，我们对二者的了解能将困惑最小化。目前人们对表1内sST2和半乳糖凝集素3方法之间可能存在的较大差异知之甚少。需要强调的是1种方法的结果对指明另一种方法的结果并不必要，了解这一点非常重要。而这对可以在方法间观测到大量偏移的sST2尤其适用。但是半乳糖凝集素3测量方法之间的偏移较少，获得的浓度可能取决于使用的方法。
目前用于sST2测量的商购方法不标准。方法是否有分析物经过准确定量的校准品尚未可知。为了解决这一问题，有必要用过金标方法确定sST2试验的标准。尽管BGM半乳糖凝集素3试验、ARCHITECT半乳糖凝集素3试验和VIDAS半乳糖凝集素3试验互相之间比较“协调”，但是这3个试验与R&D半乳糖凝集素3试验之间并不协调，因此也需要对半乳糖凝集素3试验进行标准化。
此外，文献并未列出表1内的方法使用的抗sST2和半乳糖凝集素3抗体检测的准确表位。因此应该阐明试验使用的特异性抗体是否能分别识别sST2和半乳糖凝集素3蛋白的一级、二级和三级结构。如果抗体不能识别分析物的一级结构表位，可以识别的表位与大多数蛋白质的比率将取决于标准纯化期间保留的表位结构。因此这个比率会在不同批次试验的生产过程中随着纯化标准的不同而发生变化。
如前文所述，循环sST2浓度的升高能通过作为IL-33的“欺骗”受体削弱IL-33的全身生物学效果。因此在循环中，sST2和IL-33能以不同的形式测量。理论上，循环中应该出现3种分析物：“游离sST2”、“游离IL-33”和“复合sST2”（即结合到IL-33的sST2）。假设存在使用捕获和检测抗体、不同选项组合检测sST2和IL-33的非竞争试验。但目前尚不明了，我们认为似乎可以使用文献中提及的试验测量“游离sST2”和“复合sST2”的总和。因此需要加深对使用不同sST2检测不同的分析物的理解。为了阐明现有sST2试验的现状，有必要对sST2分析物和试验抗体进行蛋白质晶体结构和表位图进行评估。考虑到IL-33/ST2L信号通路的影响，使用不同的试验测量同一患者的“游离sST2”、“复合sST2”和“游离IL-33”的循环浓度具有启发性。这种想法似乎有些投机，但是测量这3种分析物和循环比率可能对sST2和/或IL-33血清/血浆浓度升高的病理生理学产生更深入的理解。使用这些试验，得到的患有炎症疾病或心脏疾病患者的预后信息也会增加。
如前文指出的那样，半乳糖凝集素3同时具有细胞内和细胞外功能，具有独立浓缩能力形成单体或低聚物。文献并没有提到半乳糖凝集素3单体、二聚体或更高阶低聚物是否存在于人体循环中。如果这些物质真的存在于人体循环中，那么这将在检验分析中对使用半乳糖凝集素3检测的物质产生启示，尤其是试验抗体直接针对参与更高阶齐聚反应的N端非碳水化合物识别域时。此外，研究显示半乳糖凝集素3的多种生物学活动依赖其形成更高阶低聚物的能力，因此，测量健康和患病个体循环内的半乳糖凝集素3单体和不同低聚物的水平将会非常有趣。和上文提到的sST2浓度一样，测量相同患者体内不同的半乳糖凝集素3亚型和循环率能加深与升高的半乳糖凝集素3水平相关疾病病理生理学的理解。再次表明使用这些试验，得到的患有炎症疾病或心脏疾病患者的预后信息也会增加。
试验准确测循环内低浓度分析物的能力是一个重要问题，这具有方法依赖性。关于sST2，文献中显示使用MBL sST2试验不能准确测量健康个体的sST2浓度。相反，现有数据证实使用Presage ST2试验测量绝大多数健康个体的sST2浓度是可行的。因此，Presage试验被视为可溶性ST2测量的高敏试验。同样，文献记录记载使用BGM半乳糖凝集素3试验、ARCHITECT半乳糖凝集素3试验和VIDAS半乳糖凝集素3试验可以测量绝大多数健康个体的半乳糖凝集素3浓度。尚无发表的试验评估R&D试验测量sST2和半乳糖凝集素3的分析灵敏度。因此，这些试验是够能可靠地测量低血清/血浆浓度健康个体的分析物浓度尚无定论。了解sST2和和半乳糖凝集素3试验间的区别非常关键，因为在低灵敏度和精密度时，sST2和半乳糖凝集素3的变化非常明显。
男性sST2的参考值高于女性，但是参考值不受年龄、体重指数和肾功能的影响。因此，需要在更深入的研究中研究sST2测量基于性别的临界值。健康成人个体的性别特异性和临床证据和仍需确定。一个可能的解释是sST2合成或分泌可能受雄性激素控制（至少部分受雄性激素控制）。尽管研究不能证明健康个体中sST2和多种性激素之间的独立相关性，但是不见得sST2合成和分泌就不受雄性激素控制。需要设计特殊体外实验来阐明这一问题。Framingham研究发现通过雌激素替代状态进行分层分析时，摄入雄性激素的女性具有最低的值。健康个体的循环半乳糖凝集素3浓度和年龄或性别之间不存在关联或相关性。但是由于文献中的证据表明出现肾病和炎症疾病时循环半乳糖凝集素3浓度会升高，因此半乳糖凝集素3的参考值研究应该考虑这两种情况。我们认为参考值的研究应该强制性地依靠没有肾功能损伤和炎症疾病迹象的儿科或成人个体。
最后，需要进一步的针对性研究分别阐述儿科和成人患者心脏疾病的进展与sST2以及半乳糖凝集素3之间的关系。此外，心脏疾病已经有ST2和半乳糖凝集素3浓度升高的报告，但是ST2和半乳糖凝集素3的升高还与炎症疾病有关（如肺炎和慢性阻塞性肺病）。这强调了在计划进行疾病特异性研究时考虑非心脏共病和潜在炎症的重要性。
（参考文献略）
（摘自The Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，
版权归其所有，仅供内部参考）
编译：张凯
审校：王小茜
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