TUNEL
TUNEL
理论知识：细胞发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，基因组DNA断裂时，会暴露3’-OH末端
1、荧光法：暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化下加上荧光素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或者流式细胞仪进行检测；
2、DAB法：暴露的3’羟基末端，可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上生物素标记的dUTP，随后和辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素结合，随后在HRP的催化下通过DAB显色来检测细胞凋亡
DAB是过氧化物酶重要的显色底物之一，能被催化生成水不溶性的棕黄色产物，能直观地观察到，适用于各种斑点检测和免疫组化中的染色步骤。
DAB染色法也叫二氨基联苯胺法，用于检测细胞中过氧化物酶的活性部位，细胞颗粒中的过氧化物酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺，形成金黄色沉淀而定位于过氧化物酶活性的部位。
使用前先用蒸馏水将B显色液（1:25）稀释为工作液，然后按比例（1:25）加入A显色液，混匀后立即使用。
显色时间1-30分钟，显色时间过长可引起本底增高，故应密切观察显色过程（一般3-10分钟最理想），并在本底较浅且达到适当显色强度时以流水漂洗终止显色反应。
3、不同样本前处理方法
贴壁细胞、细胞图片：用4%多聚甲醛固定30min，PBS孵育5min
冰冻切片：用4%多聚甲醛固定30min，PBS孵育5min
石蜡切片：固定、脱水、包埋、切片、脱蜡水化
4、染色
｜1、DAB法：加生物素标记液—DAB显色—苏木素染
｜ 核—脱水、二甲苯透明、封片
3%过氢封闭--蛋白酶K消化—- ｜
｜2、荧光法：加荧光色标记液—DAPI染核—抗荧光淬
｜ 灭剂封片
Eg.石蜡切片
1、 脱蜡与水化
目的：使组织尽量恢复到脱水前状态，方便后续实验的进行，确保试剂能够充分与组织发生反应
操作方法：
1、60摄氏度✖️20min—-〉二甲苯：2✖️10min；100
2、100%乙醇：2✖️5min
3、95%乙醇 2min
4、80%乙醇 2min
5、70%乙醇 2min
6、蒸馏水洗5min
7、PBS 3✖️3min
2、封闭内源性过氧化物酶
目的：降低内源性过氧化物酶的活性；在DAB显色中结果容易收到内源性过氧化物酶的影响，必须使用过氧化氢等进行灭活
操作方法：3% H2O2 10min；PBS 3✖️3min
3、蛋白酶K消化
目的：消化胰蛋白酶，增加细胞膜通透性，使TDT酶更容易透过细胞膜与细胞发生 反应
操作方法：在样品上滴加20ul不含DNase的蛋白酶K，37摄氏度孵育15-30min；PBS洗三次
4、标记
目的：暴露的3’-OH在TdT酶的催化下与标记荧光素/生物素的dUTP结合
操作方法： 1）在样品上滴加50ul荧光素/生物素标记液，37摄氏度避光孵育60min； 2）PBS洗三次
5、Streptavidin-HRP标记+DAB显色（DAB法）【荧光法可省略】
目的：带有HRP标记的Streptavidin与生物素相结合，在HRP催化下通过DAB显色
操作方法：1）在样品上滴加50ulstreptavidin-HRP工作液，室温孵育30min
2）PBS洗三次
3）添加0.2-0.5mlDAB显色液，根据显色情况室温显色5-30min
4）PBS洗三次
6、染核
目的：复染细胞核，能更好判断细胞凋亡程度
操作方法：DAB法：苏木素染核，PBS洗三次
荧光法：DAPI染核，PBS洗三次（整个过程避光操作）
7、脱水、透明、封片
目的：能在显微镜下更好观察染色结果，延长染色切片保存时间
操作方法：DAB法：梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
荧光法：不需要脱水和透明，抗荧光淬灭剂封片
注意：封片是不要产生气泡，以免影响镜检。
8、实验结果解析
阳性结果：组织切片细胞核部位出现凋亡信号，无背景色
阴性对照：整张组织切片无凋亡信号
染色背景深：
DAB法：实验过程中冲洗不充分；内源性过氧化物酶的干扰；干片；DAB显色时间长；孵育温度过高；TUNEL反应液的非特异性染色
荧光法：实验过程中冲洗不充分；TUNEL反应液的非特异性染色
异常结果分析：
1、实验结果无阳性
DAB法：标记液孵育时间短；DAB显色时间短
荧光法：标记液孵育时间过短；荧光显色没有避光操作，荧光淬灭
2、阴性对照有显色
DAB法：实验过程中冲洗不充分；内源性过氧化物酶的干扰；DAB显色时间过长
荧光法：实验过程中冲洗不充分