基因敲入鼠构建/设计方法

（一）ROSA26位点定敲入鼠的构建

关于ROSA26位点

ROSA26位点位于小鼠基因组第6号染色体上，表达四个非编码的转录本。研究证实，这个位点的基因敲入对细胞及小鼠的健康无副作用，并能保证转入基因的正常稳定表达。该位点的两个等位区都带有外源插入片段的纯合子小鼠幼崽出生率略低于杂合子幼崽，但是也能正常发育并繁殖。结构图如下所示：

图1.  ROSA26位点4个转录本

定点敲入的设计与构建

①首先需要一种基因编辑技术将ROSA26位点切开，方便该位点进行同源重组，如CRISPR/Cas9技术。由此，需要设计剪切ROSA26位点的CRISPR/Cas9系统向导RNA；

②另一方面，设计插入基因A，并在基因A两侧设计ROAS26位点的同源臂；

③将该同源重组供体（Donor）与CRISPR/Cas9相关RNA一同注射入小鼠受精卵中，利用CRISPR/Cas9在ROSA26位点形成DNA双链断裂，再利用同源重组将外源基因整合入ROSA26位点。

图2.ROSA 26位点基因敲入策略示意图

基因敲入小鼠的其余构建过程与基因敲除类似，经过gRNA设计和筛选，sgRNA表达载体构建，显微注射，胚胎移植，小鼠培育及繁殖及小鼠基因型鉴定等过程。不同的是，需要额外设计插入片段，即整合入ROSA26位点的片段。

（二）点突变的原位点敲入鼠构建

基于基因敲入技术的点突变鼠是也通过类似基因敲除的手段切割该段基因，随后利用同源重组原理，将经过点突变的片段整合入原基因组位点来构建的。若以CRISPR/Cas9基因编辑技术切割基因，需要设计该段基因的CRISPR/Cas9剪切向导RNA，以及经过点突变的基因片段，用以整合入基因组。随后将这些片段通过显微注射的方式打入小鼠受精卵，等待胚胎发育，经过鉴定幼崽即可得到想要的点突变鼠。