SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤
概述
SDS-PAGE作用机理
蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样
缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠
（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘 aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯与 Pro¯之间和 Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使 Pro¯向 Cl¯迁移，—COO¯向 Pro¯迁移。如：一个 Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。
PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶，如下图：
注：催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。
加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围：
| 丙烯酰胺浓度（％） | 线性分离范围（KD） |
| 15 | 10～ 43 |
| 12 | 12～ 60 |
| 10 | 20～ 80 |
| 7.5 | 36～ 94 |
| 5.0 | 57～212 |
试剂及主要器材
通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂：
1、主要试剂
30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加双蒸水至100mL。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。
分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g，加双蒸水溶解，6mol/L HCl调pH8.8，定容100mL。4℃冰箱保存
浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g，加水溶解，6mol/L HCl调8，并定容到100mL。4℃冰箱保存
电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。
10％SDS，室温保存
质量浓度10％过硫酸铵(新鲜配制)
上样缓冲液：5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。
考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：1g考马斯亮蓝R250，加入450甲醇，100ml冰醋酸
脱色液（1L）：100ml甲醇，100ml冰醋酸
未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL )
2、实验器材
垂直板电泳槽
电泳仪
长滴管及微量加样器
烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cm´l5cm)
枪头（1ml、200ul、10ul）
注射器等
SDS-PAGE所需溶液：
A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。
C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。
D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。
E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，低温保存。
聚丙烯酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择TRIS-HCL系统。
TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。
十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。
SDS-PAGE实验标准操作流程
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉 轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
配 12％分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 3ml的吸管或10ml 枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置12％的分离胶和5.1％的浓缩胶。
| 试剂名称 | 12%的分离胶(8块，35ml) | 5.1%的浓缩胶（8块，12ml） |
| 30％凝胶贮备液/ml | 14 | 2 |
| 分离胶缓液
（pH8.8）/ml |
8.75 | |
| 浓缩胶缓冲液（pH6.8)/ml | 3 | |
| 双蒸水/ml | 12.25 | 6.9 |
| 10%过硫酸铵/ul | 175 | 100 |
| TEMED/ul | 15 | 10 |
注：分离胶与浓缩胶的浓度计算公式：
A%*Va/V总 =C ，A%为30％凝胶贮备液，
例如，12%的分离胶：0.3*10/25=12%
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
按前面方法配 5.1％的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
测完蛋白含量后，计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（上样总体积一般不超过 15μl，加样孔的最大限度可加 20μl 样品。）上样前要将样品于沸水中煮 5min 使蛋白变性。
加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 次，以免交叉污染。
3. 电泳
加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约0.5-1小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
电泳。
4. 染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻 轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。
5. 结果处理
测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。
按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)
相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)
标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。
测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。
SDS-PAGE电泳实例图
注意事项
APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。
玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时注意安全，戴手套。（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。）
凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。
点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。（点在边上时，跑出的带是斜的）
点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。
电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）。
脱色时，尽量多次进行换水。
上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl。
做胶时，凝胶时间控制在25min。梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
上样时，Marker最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。
制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气泡。
分离胶缓冲液的pH一定要准确，尽量在20℃左右调掉8.8
安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。
凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
微量注射器（加样器）上样时, 注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔。
剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
注意：温度，时间，光照，APS和TEMED都会对凝胶产生影响
查看SDS-PAGE实验FAQ：SDS-PAGE常见问题（FAQ）