基因功能的分化 (Divergence of gene function) 一般由基因突变，重复和缺失引起，也是进化的主要驱动力。但是在整个地球生命演化的时间尺度上研究基因功能的分化并不容易，因为不同物种间巨大的进化距离使我们很难区分在不同（物种）发育背景下发挥不同功能的同源基因到底是获得了新分化的功能还是依靠其固有的保守多效性【1】。跨物种比较遗传学研究的一个主要瓶颈就是可利用的自然或人工等位变异 (Alleles) 太少，因此类似的研究通常也只能揭示基因多效性的冰山一角，而对于完整理解基因的功能却无能为力。这可能导致在基因功能分化的界定上张冠李戴【2, 3】。更有甚者，一些极端突变比如胚致死突变具有发育上的上位性 (Developmental epistasis) ，从而会掩盖基因的其他功能。因此，同源基因在多大程度上经历了功能分化；抑或是有限的等位变异多样性使得保守的基因多效性被深深的隐藏了? 这在许多研究中仍没有明确的认识。同源异型 (HOMEOBOX) 基因, 是一类包含有长约180 bp HOMWOBOX基序的基因的统称。该类基因于1984年被发现，广泛存在于不同物种中，在进化上高度保守，其控制生长和发育，对于理解物种的胚胎发育和进化有重要意义。1995年，美国加利福尼亚理工学院的爱德华·刘易斯，美国普林顿大学的埃里克·维绍斯和德国马克斯·普莱克发育生物研究所的女科学家克里斯蒂安·尼斯莱因·福尔哈德三位科学家因在HOMEOBOX研究中做出的突出贡献，而获得诺贝尔生理医学奖。在植物中，WUSCHEL HOMEOBOX (WOX) 基因是一类非常重要的同源异型基因家族，通过调控分生组织干细胞的产生和成熟来控制植物生长和发育。不同植物的WOX同源基因虽然具有在分生组织功能上的保守性。但也有研究报道了该类基因功能上的分化。比如，十字花科拟南芥WOX8，WOX9基因突变体， wox9或wox8 wox9具有胚发育缺陷表型【4】。茄科植物番茄有一个WOX8/9同源基因，该基因的多个等位突变导致花序过量分枝【5】；而在番茄的两个近亲物种辣椒和矮牵牛中，wox8/9突变导致茎分生组织增生，却不产生花。禾本科植物水稻中，wox8/9突变不但导致侧枝分生组织增生，而且还导致节间缩短并影响花序分枝【6】。因此，这些跨物种的遗传分析似乎表明，WOX8/9基因在短期和长期的进化尺度上都发生了功能分化。但是，在目前缺乏WOX8/9等位变异多样性；并且考虑物种特异的生长和发育过程的前提下，对以上表型的解释所得出的这一结论可能并不一定正确。基因功能的分化可源于影响蛋白功能的编码区的突变，也可由顺式调控区域的突变而来。顺式调控区域包含大量序列，可与细胞内分子产生非常复杂的相互作用，因此提供了非常大的变异空间，从而在质量和数量上来影响基因在整个发育过程中在不同组织的表达以及由此产生的表型。因此，对这些区域的精细研究能够强有力的揭示基因多效性，并且能够对基因的多效功能是保守的还是经过分化产生的做出准确的区分。为解决上述基因功能多效性在进化上的保守性或分化性问题，来自冷泉港实验室的Zachary Lippman教授课题组与多个单位合作，采用CRISPR-Cas9多通道突变驱动系统 (CRISPR-Cas9 multiplex mutagenesis drive system)【7】，获得了大量的番茄WOX8/9启动子区域等位变异株系，结合染色质可及性及大量遗传实验揭示了该基因的功能多效性是进化上高度保守的，而非经过功能分化产生。研究发现，一些被深藏的极度保守的基因多效性可能在植物进化中是广泛存在的。该研究表明，靶向的顺式调控突变能够揭示基因保守功能，从而可以应用在作物改良中以降低不良影响，对农业生产及作物改良有突破性指导意义。该研究以番茄WOX9基因 (SlWOX9) 为研究对象。该基因的所有已知自然变异都造成番茄生殖分生组织过量增殖，从而导致大量花序分枝表型。这与拟南芥中该基因调控胚发育的作用相矛盾。因此为检测番茄wox9突变是否具有其他表型，作者创建了造成蛋白移码的wox9无效突变，并发现该突变体具有与拟南芥wox9一样完全胚致死表型。对已有的导致花序分枝的四个启动子区域基因编辑突变体 (slwox9pro)的细致表型分析发现多个外显的营养生长缺陷 (vegetative defects) ，这些新发现的表型同样与在其他物种中已知的wox9突变体表型一致。这些分析表明SlWOX9同时在营养生长和生殖生长中发挥作用，并且其早期的胚发育功能与拟南芥中该基因功能保守。虽然已有的slwox9pro等位基因可以揭示其在营养生长中的作用，但并不足以表明是否SlWOX9的多效性受某些特定的顺式调控区域控制。因此作者利用覆盖了大概3.7kb SlWOX9启动子区域的基因编辑系统（CRISPR-Cas9 multiplex mutagenesis drive system）分离到额外的23个不同形式的slwox9pro等位变异。ATAC-seq表明SlWOX9启动子有四个峰 (peak)，其中两个都在CRISPR-Cas9的靶标区域内。作者发现其中15个slwox9pro等位变异具有花序分枝表型，并且与第二个ATAC-seq峰 (peak-2) 片段的缺失紧密相关。表明该区域与SlWOX9基因的花序功能相关。两个slwox9pro等位变异具有胚致死表型，并且都缺失或部分缺失了第一个ATAC-seq峰 (peak-1) 。而且，凡是在peak-1区域有变异的株系都表现出不同程度的茎顶端分生组织 (SAM) 终止表型。而相应的另一个等位突变s-n5568，虽然缺失了大部分远端启动子区，但具有完整的peak-1区域，并没有SAM终止表型。通过对两个peak区域更加精细的CRISPR突变及分析验证了这两个区域对于SlWOX9分别在生殖生长和胚发育中的功能。作者进一步想了解这些功能特定的顺式调控区域是否存在进化意义，通过自己开发的算法，结合已被测序的十个茄科物种的基因组数据，评估了非编码区的保守性，并发现SlWOX9启动子具有相对较高的保守性。同时作者选取了番茄的近亲物种灯笼果 (groundcherry) 作为研究对象，发现WOX9编码区突变会导致和番茄无效突变相似的胚致死表型。通过类似的启动子区CRISPR-Cas9突变分析验证了与番茄相似的基因多效表型。这些结果表明，在茄科物种中，WOX9基因的多效功能以及控制这些功能的顺式调控区域在进化上并没有经历功能分化，而是保守的。那么另一个问题就产生了， WOX9基因调控包括花序发育在内的多效功能是否在进化上关系较远的十字花科植物拟南芥中也是保守的呢？由于技术原因，作者并没有获得两个启动子区域内CRISPR-Cas9等位突变的稳定转基因株系。因此作者利用RNAi降低WOX9基因的表达水平，并发现WOX9表达降低一半可使拟南芥产生类似花序的结构。该结果表明拟南芥WOX9基因同样具有与番茄WOX9基因类似的多效性，同时也进一步表明由这些植物同源异型基因所控制的发育多样性是深度保守的。植物同源异型基因WOX9的功能多效性是深度保守的，而并非发生了功能分化。综上所述，该研究通过对不同物种WOX9基因顺式调控DNA的体内功能解析，发现了植物同源异型基因的深度保守的多效性，并且不同的功能多效性可以与特定的调控元件相对应。因此，至少在WOX9基因上表明其在不同物种中的功能多效性并非是经过功能分化产生的。所以，一些深度保守的基因多效性可能在植物进化中是广泛存在的。同时，该发现对于基因组编辑技术在农业研究中的应用具有重要的指导作用：可通过靶向特定调控区域来达到调节特定功能的目的，从而能尽量降低对非目标性状的不良影响。
参考文献
【1】 Stern, D.L. (2000). Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution 54, 1079–1091.
【2】 Visscher, P.M., and Yang, J. (2016). A plethora of pleiotropy across complex traits. Nat. Genet. 48, 707–708.
【3】 Wagner, G.P., and Zhang, J. (2011). The pleiotropic structure of the genotype phenotype map: the evolvability of complex organisms. Nat. Rev. Genet. 12, 204–213.
【4】 Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., and Laux, T. (2008). Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev. Cell 14, 867–876.
【5】 Lippman, Z.B., Cohen, O., Alvarez, J.P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., and Zamir, D. (2008). The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288.
【6】 Wang, W., Li, G., Zhao, J., Chu, H., Lin, W., Zhang, D., Wang, Z., and Liang,W. (2014). Dwarf Tiller1, a Wuschel-related homeobox transcription factor, is required for tiller growth in rice. PLoS Genet. 10, e1004154.
【7】 Rodrı´guez-Leal, D., Lemmon, Z.H., Man, J., Bartlett, M.E., and Lippman, Z.B. (2017). Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing. Cell 171, 470–480.e8.
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00151-3
