miRNA的qPCR方法笔记（茎环引物法与加尾法）

前言

microRNA（后方简称miRNA）的长度比较短，通常是20nt到24nt长度，因此用常规的qPCR法很难对其直接定量。现在常用的对miRNA的定量方法主要有三种，分别为加尾法，茎环引物法，探针法。这篇笔记主要以mmu-miR-30d-50为例总结一下这前两种方法，因为探针法的原理与实验步骤我以前总结过。就我自己的看法，这三种方法最根本的原理就是延长miRNA。

茎环引物法

原理

茎环引物是一种能够自身环化的长引物，它的长度约为45bp。下面是茎环引物的示意图：

茎环引物的使用流程：

第一步：在反转录过程中，茎环逆转录引物（需要自己设计）与miRNA结合，反转录为cDNA；

第二步：在qPCR过程中，茎环结构打开，两条引物与打开茎环结构结合，其中一条引物与茎环引物上的公共序列结合，另外一条与相应的miRNA序列结合（需要自己设计），其他的miRNA也可以使用公共引物。

mmu-miR-30d-5p的茎环引物设计

第一步，查询mmu-miR-30d-5p的成熟体序列（5'->3'）如下所示：

UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG

将U转换为T，就如下所示：

TGTAAACATCCCCGACTGGAAG

第二步，设计茎环引物，茎环引物由两部分构成，一部分是通用的序列（通用序列有很多种，这里只列举一种），如下所示：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC

另外一部分是针对某个miRNA特定序列，这一部分的序列是6个碱基，我们设计的是miR-30d-5p，从它的3'端，开始数取6-8个序列，即GAAGGTCA，取它的互补序列，即为CTTCCAGT，将这段序列与茎环引物的通用序列，结合，就成了miR-30d-5p的反转录引物，如下所示：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTTCCAGT

这个引物是在反转录的时候使用，它在反转录过程中的示意图如下所示：

第三步，设计qPCR引物，正向引物，每个正向引物包括5’端通用序列和3'端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。即：上游引物为5'- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ，自miRNA5’端抄起，14-16个或13-14个，这里就抄14个碱基。 通俗的说就是：保护性碱基（用来调GC含量的）+miRNA 5 端的13-16个碱基（不要抄到最后那6-8个上去了，意思就是不要与RT那段重叠了），因此miR-30d-5p的qPCR正向引物序列就是：

TCGGCAGGTGTAAACATCCCCG

反向引物，就是茎环引物上的一段序列，这里直接写为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'（就是茎环引物上的一段序列）。这两条引物在qPCR中的反应过程如下所示：

RNA提取的实验材料

Trizol（Thermo Fisher Scientific）

RNAase-Free水

无水乙醇（重庆川东化工有限公司）

氯仿（成都市科龙化工试剂厂）

异丙醇（成都市科龙化工试剂厂）

qPCR试剂盒（Takara，货号：RR820A）

反转录试剂盒（Takara，货号：RR037A）

qPCR实验过程

1.提取RNA

提取RNA，按照常规的Trizol法提取即可，最终提取并测完浓度后，将RNA样本稀释到300ng/uL的浓度，并分装到3个EP管中，并取一部分出来，进行质控。质控的内容包括：1.2%的琼脂糖电泳，电压120V，40分钟，上样量200ng。

2. 反转录

  1. 反转录采用Takara的反转录试剂盒，这个试剂盒是常规的反转录试剂盒，在反转录miRNA的时候，不需要试剂盒里面的2个引物，即成分3（Oligo dT primer）和成分4（Random 6 mers），使用自己设计的茎环引物进行反转，反转体系如下所示（20μL体系）：

    成分 体积
    5XPrimeScript Buffer 4
    PrimeScript RT Enzyme Mix I 1
    茎环引物 1
    总RNA 1
    无RNAase水 20μL

PCR程序为：

  1. Step 1：37, 15min
  2. Step 2：85 , 5 sec
  3. Step 3：4 , 5min

3. qPCR反应

反应体系如下所示：

组分 体积(μL)
2×SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10
Forward Primer(10μM) 1
Reverse Primer(10μM) 1
cDNA Template 1
ddH2O To 20μL

(2)PCR反应条件：

第一步：预变性条件95/10s；1 cycle；

第二步：PCR反应条件95/5s，60/30s，70/20s；40 cycles；

第三步：融解曲线分析95 0s，20/s，65 15s，20/s ，95 0s ，0.1/s。

分析数据即可。

茎环引物法的优缺点

茎环引物法的优点就在于特异性强，成本低。缺点就是一次只能针对一种特定的miRNA进行检测，而加尾法则能够对miRNA进行批量筛选。

加尾法

原理

加尾法的根本原理也是延长miRNA，然后再用上下游引物来进行qPCR。

在这里，还以miR-30d-5p为例，以及Takara的一个miRNA试剂盒为例说明一下加尾法的原理，参考资料主要是该试剂盒的说明书，即Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis and SYBR® qRT-PCR User Manual。这个试剂盒里面有这些成分：mRQ Enzyme Mix；mRQ Buffer (2X)；mRQ 3’ Primer (10 μM) ；U6 Forward Primer (10 μM)；U6 Reverse Primer (10 μM)。

其中，mRQ Enzyme Mix中含有poly(A)聚合酶，该酶向miRNA的3'末端添加poly(A)尾，此外还含有SMART MMLV逆转录酶，这个酶主要用于将加了poly(A)的RNA反转录为cDNA。mRQ buffer是缓冲液，很好理解；mRA 3' Primer这个我猜测可能是进行qPCR反应时的公共引物；与是U6的内参，这个也好理解。

整个反转录过程如下所示：

以上就是加尾法对miRNA进行检测的原理。这里只是以mmu-miR-30d-5p为例说明了一下，其实它也可以是miR-770-5p，也可以是miR-21-3p等，一次反转录几乎能够把细胞内的所有miRNA都给反转录成cDNA。因此，如果批量对miRNA进行qPCR筛选的话，加尾法是一种比较合适的方法，它只需要设计针对某个miRNA的特异引物即可，这样一次反转录生成的cDNA就可以重复做多个miRNA的检测。

加尾法的上游引物设计

从原理图上可以知，例如针对miR-30d-5p的引物其实就是miR-30d-5p序列本身，只是把U变成了T。例如miR-30d-5p的成熟体序列为UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG，那么它的加尾法上游引物就是TGTAAACATCCCCGACTGGAAG。

qPCR反应

加尾法的qPCR反应体系跟普通的qPCR体系一样，程序也类似（如果一次筛选大量的miRNA，则需要优化一下退火温度）。

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