cellranger更新到6.0啦

不知不觉cellranger已经更新到6.0了。前面已经介绍了4、5，今天介绍下6.0

CellRanger作为10x genomic公司专为单细胞转录组分析提供的分析软件，可实现从Illumina原始数据（BCL或fastq格式）到文库拆分，细胞拆分及定量，pca，聚类以及可视化（t-SNE和UMAP）结果。该软件高度集成化，即使您不会写代码也可以快速掌握其用法，使单细胞研究简单化。

cellranger主要有4个流程：

  • mkfastq、
  • 定量 count、
  • 组合 aggr、
  • reanalyze。

如果是bcl原始测序数据，需用mkfastq转换为fastq格式(根据index将reads分配至不同的样本)。

如果是fastq格式数据，则可直接用count命令定量，得到表达矩阵，然后用aggr命令整合样本(比如实验组有多个重复样本)，最后reanalyze进行后续降维聚类等等分析。（最简单的流程：如果是单个样本，只用count命令+R包即可）

本教程主要目的是从SRA或者Fastq文件完成cellranger count流程得到10x的三个文件。流程如下

1.cellranger软件下载及安装

首先创建并激活一个小环境

conda create -n cellranger
conda activate cellranger

下载cellranger并解压

在网页[1]简单注册后就可以获取wget下载地址。

cd /opt

wget -O cellranger-6.0.2.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-6.0.2.tar.gz?Expires=1624477084&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci02LjAuMi50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2MjQ0NzcwODR9fX1dfQ__&Signature=QCESOlCkbmpiDLNQEHVVCZWRUQlK01zJ28z34ezOgcb2dH7yyv0zZvWw816nE7jrOfiuiD2COZ6zf8kaL~7ndl9sfKQ~JLSWYbgZgUXb6fjehKNOJggzd32mS29lZ1cAFZBgwH~pmYEmFIIx1WIuyEKi6XZ4O6Yquc0~fUA80ZkdMoNrDGGXtgn7RgRoK4MWwGgQtsufw9J5wLXe5XQG70cmg14wd-ZGjrboK~LMBDSYfkZr2YG8Sl2ScJIbB9xKfszcyXlq65EQwFuwzmSAxvNh9uIr9YlfSeUM-uNqdc1hYkin4Q1-1nGEfAaudHgzddD45-KxBKfv0KaL-vcLBA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

tar -xzvf cellranger-6.0.2.tar.gz

下载速度就取决于你自己的网路情况啦，建议nohup到后台，等待即可。将cellranger添加到环境变量，方便后续使用

vim ~/.bashrc
$ export PATH=/opt/cellranger-6.0.2:$PATH
source ~/.bashrc

2.下载参考基因组并解压

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

3.准备数据

既然你都要学cellranger了，大概率上你已经有了SRA或者fastq数据，有了服务器，linux知识也有所了解，关于数据的下载我就不赘述了。

本次演示我们的数据来自2018年9月的NC文章Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA[2]。为了展示方便，我们只使用其中一个SRR数据。

认识10x的fastq数据文件

官网给指出来了文件名规则:[3]，如果你的fastq数据不是这样命名，就需要自行更改过来了。

zless 查看文件大小

zless -SN SRR7722937_1.fastq.gz
zless -SN SRR7722937_2.fastq.gz
zless -SN SRR7722937_3.fastq.gz

其中第一个文件的所有序列都是8bp，第二个文件都是26bp，第三个文件都是91bp，初步判断，第三个文件是测序reads

如果要理解这3个文件的区别，同理，也是需要自己去学习了解10x的原理：

看看测序时每个run cycle做了什么事：

利用illumina边合成变测序（sequencing by synthesis ,SBS），每一个cycle都是一个碱基，因此用cycle数可以表示测序长度

  • 首先，1-26个cycle就是测序得到了26个碱基，先是16个Barcode碱基，然后是10个UMI碱基；
  • 然后，27-34这8个cycle得到了8个碱基，就是i7的sample index；
  • 最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads

4. 使用cellranger count进行定量

Cell Ranger主要的流程有：拆分数据 mkfastq、细胞定量 count、定量组合 aggr、调参reanalyze，还有一些小工具比如mkref、mkgtf、upload、sitecheck、mat2csv、vdj、mkvdjref、testrun。

但是，大概率上，我们只需要使用它的定量流程，就是 cellranger count 命令。如下

当然你也可以写个脚本转后台，这都是后话了。

>cellranger count --id=sample6231429 \
 --transcriptome=/home/rstudio/data/ref/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0 \
 --fastqs=/home/rstudio/data/raw0 \
 --sample=SRR7722937 \
 --nosecondary
# id指定输出文件存放目录名
# transcriptome指定与CellRanger兼容的参考基因组
# fastqs指定mkfastq或者自定义的测序文件
# sample要和fastq文件的前缀中的sample保持一致，作为软件识别的标志
# expect-cells指定复现的细胞数量，这个要和实验设计结合起来
# nosecondary 只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化分析(因为后期会自行用R包去做)

服务器配置不一样，这个cellranger count流程运行时间不一样，这一个样本是约3G的fq文件数据走这个流程是2小时。我的服务器是配置是32核40线程128G内存

5.输出结果

运行结束得到结果如下：

Outputs:
- Run summary HTML:                      /home/rstudio/data/sample6231429/outs/web_summary.html
- Run summary CSV:                       /home/rstudio/data/sample6231429/outs/metrics_summary.csv
- BAM:                                   /home/rstudio/data/sample6231429/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index:                             /home/rstudio/data/sample6231429/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered gene-barcode matrices MEX:    /home/rstudio/data/sample6231429/outs/filtered_gene_bc_matrices
- Filtered gene-barcode matrices HDF5:   /home/rstudio/data/sample6231429/outs/filtered_gene_bc_matrices_h5.h5
- Unfiltered gene-barcode matrices MEX:  /home/rstudio/data/sample6231429/outs/raw_gene_bc_matrices
- Unfiltered gene-barcode matrices HDF5: /home/rstudio/data/sample6231429/outs/raw_gene_bc_matrices_h5.h5
- Secondary analysis output CSV:         null
- Per-molecule read information:         /home/rstudio/data/sample6231429/outs/molecule_info.h5
- Loupe Cell Browser file:               null

Pipestance completed successfully!

Saving pipestance info to sample6231429/sample6231429.mri.tgz
(cellrangerze) root 08:42:19 /home/rstudio/data

重要输出结果说明：filtered_gene_bc_matrices：是重要的一个目录，下面又包含了 barcodes.tsv、features.tsv、matrix.mtx，是下游Seurat、Scater、Monocle等分析的输入文件。

web_summary.html：质控比对报告(一般认为外显子的比对率要在60%以上)。barcode用来标记细胞，UMI用来标记转录本；其次，barcodes数量是要大于细胞数量的（以保证每个细胞都会有barcode来进行区分)。

6.一些术语解释

index标记样本，barcode标记细胞，UMI标记转录本。

i7 sample index (library barcode)
是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。它的作用就是在CellRanger的mkfastq 功能中体现出来的，它自动识别样本index名称（例如：SA-GA-A1），将具有相同4种oligo的fq文件组合在一起，表示同一个样本。它保证了一个测序lane上可以容纳多个样本。一个index set有4个oligos。

Barcode
是10X特有的，用来区分GEMs，也就是对细胞做了一个标记。一般在拆分混样测序数据（demultiplexing）这个过程后进行操作，当然这也很符合原文的操作。

UMI
UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，根据PCR结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。它的主要作用是，处理PCR 扩增偏差，因为起始文库很小时需要的PCR扩增次数就越多，因为越容易引入扩增误差。

v2 chemistry和v3 chemistry的区别
和V2相比，V3试剂盒中所用的UMI和PolyT的长度都发生了变化，从而导致测序得到的R1和R2端的序列长度也不一致，V2试剂盒的R1端长度为26bp, 包含16bp的barcode和10bp的UMI序列，V3试剂盒的R1端长度为28bp, 包含16bp的barcode和12bp的UMI序列；V2试剂盒的R2端为98bp, V3试剂盒的R2端为91bp。

参考资料

[1]

网页: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

[2]

Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA: https://links.jianshu.com/go?to=https%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Farticles%2Fs41467-018-06300-3

[3]

文件名规则:: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/2.0/using/fastq-input#wrongname

[4]

CellRanger使用学习: https://www.jianshu.com/p/11c4537feb4b

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