恶性肿瘤合并肝转移，为什么免疫治疗效果差？

免疫检查点抑制剂疗法（CPIS）的出现，给恶性肿瘤的治疗和总体生存带来了很多惊喜，但在临床上，大部分恶性肿瘤合并肝转移的患者，比如黑色素瘤、肺癌、肾癌等，接受免疫治疗的疗效都是比较差的，明显比没有肝转移的患者差很多，为什么呢？现在终于有答案了！

《SCIENCE IMMUNOLOGY》 2020 年 10 月发表的一篇美国加州大学的研究报告对此做出了解释。

肝转移可调节全身抗肿瘤免疫，而这些患者 CPI 抵抗背后的机制基础还不清楚。以前对肝脏耐受性的研究要么集中在癌症以外的环境（如传染病、移植、自身免疫性疾病），要么就是提示肝转移前的潜在可能和癌症相关的免疫抑制是基于肝实质范围内的局部效应。

但是这些研究均不能解释肝脏耐受性对全身或非稳态抗肿瘤免疫的潜在影响，更不能解决临床上的问题。因此，我们迫切需要了解肝转移 CPI 治疗失败的机制，并找出可能提高疗效的策略。

一、肝脏肿瘤降低远处抗肿瘤免疫以及抗 PD-1 免疫治疗的全身反应

图 1

该研究发现，将同基因 MC38 肿瘤细胞皮下注射给无免疫能力的 C57BL/6（B6）小鼠，同时将MC38细胞注射到肝脏或肺部（图1A），肝脏内肿瘤小鼠的远处SQ肿瘤的肿瘤生长明显增加（图1B）。

既往研究表明，活化标记物 PD-1 和 CTLA-4 在 CD8+TILs 上的高水平表达与肿瘤免疫有关，并预测对CPI有更好的疗效。

该研究分析了三组肿瘤浸润 CD8+T 细胞表面 PD-1 和细胞内 CTLA-4 的表达发现，与患有肺肿瘤的小鼠和对照鼠（仅限 SQ 肿瘤）相比，携带肝脏肿瘤的小鼠的 SQ-CD8+TIL上PD-1 和 CTLA-4 表达的百分比显著降低（图 1C）。

为了验证抗PD-1免疫治疗对该模型的影响，研究者对三组小鼠注射了抗小鼠 PD-1 单克隆抗体（mAb），发现携带 SQ 和肝脏肿瘤的小鼠对抗 PD-1 单药治疗不敏感（图 1 D和E），且肝肿瘤小鼠存活率降低和抗 PD-1 应答率低与肝毒性或肝脏疾病无关功能。从荷肝肿瘤小鼠分离的 SQ-CD8+TIL 上，PD-1 和 CTLA-4 共表达细胞的频率显著降低，CTLA-4 和 PD-1 的平均荧光强度（MFI）较低（图 1F）

二、肝脏促进远期肿瘤抗原特异性免疫抑制，而不受肿瘤负荷的影响

图 2

为了研究肿瘤负荷的增加是否是免疫抑制的原因，将等量的肿瘤植入不同的宿主解剖部位，以检测对远处 SQ 部位的免疫抑制作用。

免疫缺陷型 NOD-scid-gamma（NSG）或 Rag-1–/− 小鼠植入继发性肝肿瘤后，SQ 肿瘤生长没有显著差异（图 2B），这表明远端 SQ 部位肿瘤生长的调节依赖于适应性免疫。将 ir 辐射的 MC38 肿瘤细胞单独植入肿瘤内肿瘤生长显著增加（图 2B）。10 倍种植-少辐射MC38肿瘤细胞显示出相似的结果（图 2C）。将一个无关的 B16F10 肿瘤植入肝脏并不能促进远处 SQ 部位的肿瘤生长（图 2D），说明肝脏介导的免疫抑制是肿瘤抗原特异性的。

图 3

三、肝转移与 TILs 的表型变化有关

除上述 PD-1 和 CTLA-4 外，其他激活标志物，包括诱导性T细胞协同刺激物（ICOS）和效应细胞因子，也被证明因肝脏肿瘤的存在而改变，并与抗肿瘤反应相关。

在肝转移小鼠中， CTLA-4、ICOS和干扰素 γ（IFNγ）的表达在分离的 CD8+T 细胞上显著降低（图 3 B、C）。而且基于多种激活标记物 PD-1、CTLA-4、ICOS 和 Ki-67 的共同表达，大多数高活性 T 细胞亚群受到的影响最为显著。常规 CD4+TILs 在 SQ 肿瘤内荷肝肿瘤小鼠的 ICOS 表达较低，但 PD-1 表达较高（图 3B）。表明传统 CD4+TIL 上 ICOS 的表达与增强的抗肿瘤免疫有关，而 PD-1 的高表达与抗肿瘤反应的降低相关。

图 4

虽然 Foxp3+Tregs 的百分比和绝对 Treg 数无显著差异（图 4 A 和 B），但肝转移小鼠的肿瘤组织中 PD-1、CTLA-4 和 ICOS 的表达显著高于对照组（图 3D）。在第二个肿瘤模型 B16F10 黑色素瘤模型中进行了类似的实验，观察到了相似的结果，即小鼠与同种肝肿瘤共同注射后，SQ 肿瘤的生长显著增强，并且降低了激活标记物和细胞因子在与 SQ 肿瘤相关的细胞毒性T细胞中的表达（图 S5）。

四、Tregs 控制肝肿瘤远处肿瘤免疫的抑制

图 5

大量证据表明，Tregs 在肝脏免疫耐受中起着重要作用，并能抑制 CD8+T 细胞活性和细胞毒性。因此，在 Foxp3（FP3-DTR） 的控制下，使用表达白喉毒素（DT）受体的小鼠株选择性地消耗 Tregs，以检测 Tregs 在系统抑制中的潜在影响。结果表明Tregs参与了肝脏肿瘤特异性抑制（图 3G）。此外，基于 ICOS、IFNγ 和 CD107a 表达的显著增加，Tregs 的缺失恢复了肿瘤特异性CD8+T细胞的激活和功能状态（图 3H和I）。DT 处理组 PD-1 表达较低。这一结果可能是由于肿瘤负荷减少（由 Treg 耗竭引起）引起。总的来说，在肝脏肿瘤存在的情况下， Tregs 在调节远处肿瘤特异性 CD8+T 细胞免疫中起着关键作用。

五、Treg 缺失或失活逆转肝脏肿瘤相关的全身免疫抑制

以上结果提示，Tregs 可能是抗 PD-1 单药治疗不能诱导肿瘤消退的原因。因此，该研究使用两种独立的方案来选择性地破坏 Tregs，看看它是否能与抗 PD-1 治疗协同作用。结果表明，在抗 PD-1 单药无效的肝肿瘤介导免疫抑制中，包括 PD-1 检查点阻断和 Treg 功能耗竭或破坏的联合策略可以增强持久的抗肿瘤免疫。

为了验证 Treg 耗竭对抗 CTLA-4 活性，比较两种药物的抗肿瘤作用，发现只有 Treg 缺失的 IgG2a 抗体能够在两个部位实现肿瘤的完全排斥。

肝脏 Tregs 表型分析和抑制抗肿瘤免疫效应

鉴于 Tregs 在肝肿瘤模型中的全身免疫抑制中起着重要作用，该研究试图直接比较有无肝肿瘤的小鼠的体内抑制能力，以确定 Treg 群体是否存在功能差异。结果表明，肝脏肿瘤的存在诱导了一个高度活跃的 Tregs 群体，在每个细胞的基础上更有效地抑制抗肿瘤免疫。

肿瘤中天然免疫细胞的微环境影响抗肿瘤免疫中表达基因和蛋白质

先天性肿瘤微环境中的免疫细胞重编程与抗肿瘤反应高度相关。因此，该研究利用 scRNA 序列分析了先天性免疫室细胞的转录组，发现仅在 SQ 肿瘤的单核细胞亚群中，表达与免疫抑制相关基因的细胞较少组，包括 Socs3、Xbp1、Rhoh、Wfdc17、GOs2 和 Acod1，表明肝肿瘤诱导的免疫抑制可能是 Tregs 和MDSC cross-talk 的结果。

肝肿瘤相关的 Treg 控制远端抗原特异性免疫是由耐受性 CD11b 介导的 MDSCs

以前的研究表明 Tregs 可以通过改变抗原呈递细胞（APCs）间接地对效应T细胞产生肿瘤抗原特异性抑制。提示系统性抗原特异性免疫调节机制可能与 Tregs 和 MDSCs 相互协调。该研究用 14 色荧光笔对 SQ 肿瘤微环境中的髓系/单核细胞/巨噬细胞系细胞进行了观察，结果发现，肝肿瘤组的两组细胞 CD11b+Ly6G+Ly6C- 粒细胞 MDSCs（G-MDSCs）显著增加以及 CD11b+Ly6G−Ly6C+ 单核MDSCs（M-MDSCs）。CD11b+MDSC 浸润增加， CD80/86 表达增加，仅在合并肝脏肿瘤的情况下发生，而在其他解剖部位肿瘤并没有。

对不稳定SQ肿瘤的分析表明，Tregs 的耗竭导致浸润性MDSCs的百分比降低（图6C）。此外，肿瘤微环境中剩余的 CD11b+ 单核细胞表达更高水平的 CD80/86 ，提示它们在肿瘤微环境中的功能可能被重新编程为成为能够向T细胞提供共刺激的 APCs（图 6D）。

为了验证 Tregs、CTLA-4 和 MDSCs 的关系，该研究比较了两种不同类型的小鼠抗 CTLA-4 抗体克隆 9D9。无论是用 Treg 缺失抗体还是非缺失抗体治疗，CD45+CD11b+MDSCs 上的CD80/86 表达增加；然而，只有 Treg 缺失 IgG2a 抗体导致超高压单核细胞数量减少（图 6，G 至 I）。

类似于反 -CTLA-4 9H10 抗体，只有 Treg 消耗 IgG2a 抗体。当结合抗 PD-1 抗体治疗时，治疗能够在大多数治疗小鼠的两个部位实现肿瘤的完全排斥。因此，虽然 CTLA-4 阻断可以恢复 MDSCs 上共刺激表面 CD80/86 的表达，但 Treg 的耗竭可能是进一步阻止任何抑制性 MDSCs 进入肿瘤微环境的必要条件，并且在存在肝脏肿瘤的情况下实现最大的全身抗肿瘤免疫。

图 6

在肿瘤转移部位进行的抗肿瘤免疫治疗可以显著降低肿瘤远处转移的免疫反应取决于 Tregs 和 MDSCs 之间的 cross-talk。肝脏继发性肿瘤导致肿瘤特异性免疫和 SQ 位点抗 PD-1 免疫治疗反应的显著抑制。

总之，肝脏肿瘤不仅损害肝内免疫功能，还影响远期的抗肿瘤免疫，并导致临床上系统性抗 PD-1 治疗的疗效降低。为了揭示导致 CPI 免疫治疗抵抗的潜在耐受机制，研究利用双肿瘤免疫活性小鼠模型，发现对肝脏内肿瘤抗原存在的免疫反应导致抗肿瘤的全身抑制免疫。免疫抑制是抗原特异性的，与调节性 T 细胞（Tregs）的协同激活和肿瘤内 CD11b 的调节有关。功能失调的免疫状态可能抗 PD-1 单一疗法不能逆转，除非 Treg 细胞被耗尽（抗 CTLA-4）或使用 zeste2（EZH2）抑制剂增强子的功能性抑制，可恢复全身抗肿瘤免疫和 CPI 反应。因此，临床上治疗恶性肿瘤肝转移想要取得更好的疗效应该选择抗 PD-1 联合其他靶向治疗。

六、临床上肝转移的治疗展望

尽管在临床上肝转移的疗效较差，但是与传统治疗或不治疗相比较，免疫治疗对这部分患者还是能带来一线希望。比如在KEYNOTE 001、002、006临床研究队列亚组分析中， PD-1 对黑色素瘤及 NSCLC 肝转移患的缓解率超过了其他传统疗法所报告的缓解率。结合目前的相关研究，免疫治疗的联合用药是肝转移治疗的趋势。

那与化疗联合呢？

IMpower130 及 IMpower132 研究中，肝转移亚组的患者使用免疫治疗联合化疗并未取得显著的生存获益。

联合化疗+抗血管新生呢？

IMpower150 研究，肝转移亚组获益优于非肝转移亚组的数据，可能由于抗血管生成药物与免疫治疗药物具有协同抗肿瘤的作用。

联合局部治疗也是可选择方案之一，比如立体定向身体放疗（SBRT）、经动脉化学栓塞（TACE）等联合免疫治疗在肝转移患者也能取得一定疗效。

目前有 PD-L1/CTLA-4 双抗体、PD-L1/TGF-B 双抗体等临床研究正在如火如荼进行当中，希望这些新的药物能够给肝转移患者带来更好的疗效。

本文首发：邱立新医生

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