发酵食品中降胆固醇益生菌的筛选及鉴定

高玉荣，刘立君，李本领，李大鹏

(黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319)

摘要：以发酵香肠、酸菜及酸奶为原料，通过平板分离、体外降胆固醇能力的测定及益生功能评价，筛选出1株胆

固醇降解率为69．2％的益生菌菌株s一59。该菌株不仅具有良好的耐酸能力、耐胆盐能力，而且具有较强的疏水性。

经形态学、生理生化试验，将其鉴定为嗜酸乳杆菌。

随着生活水平的提高及膳食结构的变化，人们

对高脂肪、高胆固醇食物的摄人逐渐增多，导致动

脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病患者的数量不

断增加。因此，研究和利用具有降胆固醇功能的微

生物以降低食品和人体血清中的胆固醇，对改善人

们的健康水平有重要的意义【1]。在认识了降胆固醇对

机体的有益功能后，国内外掀起了降胆固醇益生菌

研究及应用的热潮。这些研究主要集中在降胆固醇

益生菌的筛选和鉴定、降胆固醇机理，以及降胆固

醇微生物制剂和降胆固醇保健食品的开发[2-3]。本文

以酸菜、酸奶等发酵食品为原料，从中筛选具有降

胆固醇功能的益生菌，并对筛选出来的益生菌通过

形态鉴定、生理生化试验及16S rDNA序列分析进行

菌种鉴定。

1 试验材料

1．1分离原料

酸奶、酸菜、发酵香肠，市售。

1．2菌种

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，由黑龙江八一农

垦大学食品学院微生物实验室提供。

2试验方法

2．1乳酸菌的分离

将发酵香肠浸提液、酸菜汁、酸奶进行10倍梯

度稀释，分别吸取l×10。5，1×1酽，1×10。的稀释

液0．1 mL于MRS—CaCO，固体培养基平板上，涂布分

离，于37℃条件下培养24 h。将具有明显溶钙圈的

单菌落挑至MRS固体斜面上，37℃培养24 h。

2．2体外降胆固醇乳酸菌初筛

将分离出的斜面菌种置于MRS液体培养基中，

于37℃条件下培养12。14 h，进行活化。按3％的接

种量接种到含有胆固醇的MRS—CHOL培养基【l】中，

于37℃条件下培养72 h后测定其中的胆固醇含量【4】。

2．3体外降胆固醇乳酸菌的复筛

将初筛获得的胆固醇降解率较高的菌株进行复

筛，将活化的菌悬液按3％的接种量分别接种含有

0．2 mg／mL胆固醇的MRS液体培养基中，于37℃条

件下培养72 h后测定胆固醇含量[41。

2．4体外降胆固醇乳酸菌的益生功能评价

2．4．1 菌种耐酸性能评价

挑取1。2环斜面菌种到10 mL MRS液体培养基

收稿日期：2016—03—03

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究(面上)项目(12541585)。

作者简介：高玉荣(1970一)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为食品微生物与发酵工程。

万方数据

农产品加工 2016年第4期

中，于37℃条件下培养12—14 h。取5 mL菌液以转

速4 000 r／min离心10min，收集菌体，加入10mL经

盐酸(1 m洲L)调节pH值为2．0的生理盐水中，于

37℃条件下培养4 h后，通过平板计数法测细胞存

活率圈。

2．4．2菌种耐胆盐性能评价

挑取1～2环斜面菌种到10 mL MRS液体培养基

中，于37℃条件下培养12～14 h。取5 rnL菌液以转

速4 000 r／min离心10 min，收集菌体，加入10 mL

含0．3％猪胆盐的生理盐水中，于37℃条件下培养

4 h后，通过平板计数法测定细胞存活率翻。

2．4．3菌种疏水性评价

将斜面菌种进行活化，接种到MRS液体培养基

中，于37℃条件下培养14 h后，以转速4 000 r／min

离心10 min，收集菌体细胞，测定菌体细胞的疏

水性。

3结果与分析

3．1发酵食品原料中降胆固醇微生物的筛选

3．1．1乳酸菌的分离

从酸菜、发酵香肠和酸奶中，采用MRS固体培

养基，通过平板分离法分离出120株具有明显溶钙

圈且表面光滑乳白色的单菌落。

3．1．2降胆固醇微生物的初筛

降胆固醇乳酸菌的初筛见表1。

表1降胆固醇乳酸菌的初筛

菌株编号 胆固醇降解率／％ 菌株编号 胆固醇降解率／％

S-12 56．2 C一54 52．9

S—03 58．7 C-23 46．8

S一24 53．9 C-28 53．8

S一15 42．1 C-33 47．3

S-37 54．6 C-52 54．7

S一65 59_3 C-48 41．0

S一21 40．6 C-26 54．1

S一22 45．7 C—41 36．4

S-59 68．9 C一34 65．6

S-61 63．2 C一52 55．1

按照5％的接种量将活化菌株接种到含有胆固醇

的MRS液体培养基中，于37℃条件下培养72 h后，

测定体外降胆固醇的能力，共有18株菌株的降胆固

醇能力大于40％。

3．1．3降胆固醇微生物的复筛

降胆固醇乳酸菌的复筛见表2。

表2降胆固醇乳酸菌的复筛

菌株编号 胆固醇降解率／％ 菌株编号 胆固醇降解率／％

S-59 69．2 C一34 65．4

S一61 63．6 S-65 60．2

对初筛出的18株菌株进行复筛，确定降胆固醇

能力大于60％的菌株4株。

3．2降胆固醇微生物益生功能评价

(1)耐酸性能的测定。

耐酸能力的测定见表3。

表3耐酸能力的测定

由表3可知，4株菌株在酸性环境下存活率大于

30％，其中s一59在pH值为2的酸眭环境下培养4 h

后存活率最高为48．8％。

(2)耐胆盐性能的测定。

耐胆盐能力的测定见表4。

表4耐胆盐能力的测定

由表4可知，4株乳酸菌在胆盐0．3％的生理盐

水中培养4 h后存活率最高的菌株为S一61，存活率

为32．2％；其次是菌株S一59，存活率31．8％，但二

者差异不显著。

(3)疏水性的测定。

疏水性的测定见表5。

表5疏水性的测定

菌株编号 疏水率／％ 菌株编号 疏水率／％

S一59 31．6 C-34 9．46

S一61 28．7 S一65 18．20

由表5可知，菌株s一59和S一61具有较高的疏

水率，分别为31．6％和28．7％；资料报道疏水率介于

20％和50％为中度疏水，因此菌株S一59和S一61细

菌表面的疏水性达到了中度疏水，作为益生菌可以

在肠道黏膜表面黏附并定殖。

由以上益生功能及发酵性能评价结果看出，

s一59菌株不仅具有较强的降胆固醇能力，而且有较

强的耐酸、耐胆盐能力和疏水性。因此，对S一59菌

株进行后续研究。

3．3菌种鉴定

3．3．1形态鉴定

(1)个体形态鉴定。

S一59菌株显微形态(10×100)见图1。

由图1可知，S一59菌株的革兰氏染色结果为紫

万方数据

2016年第4期 高玉荣，等：发酵食品中降胆固醇益生菌的筛选及鉴定

图2 S一59菌落形态

由图2可知，S一59菌株的菌落直径为1～2 inin，

呈圆形，表面凸起，微白色，湿润且边缘整齐。

3．3．2生理生化试验

生理生化鉴定结果见表6。

根据《常用细菌系统鉴定手册》，初步将菌株鉴

定为嗜酸乳杆菌。

4结论

(1)以发酵香肠、酸菜及酸奶为原料，通过平

板分离、体外降胆固醇能力的测定获得4株降胆固

表6生理生化鉴定结果

试验项目 结果 试验项目 结果

厌氧生长 + 淀粉水解 +

15℃生长 + 硫化氢 一

pH值4．5 + 甲基红 +

运动 一 明胶 +

葡萄糖 + 产生吲哚试验 一

V—P试验 + 硝酸盐还原试验 一

酪蛋白分解试验 一 果糖试验 +

耐盐性试验 + 鼠李糖试验 一

过氧化氢酶试验 一 乳糖试验 +

蔗糖试验 + 甘露醇试验 +

核糖 + 石蕊牛奶 一

接触酶 一 精氨酸产氨 +

醇能力大于60％的菌株。

(2)通过益生功能评价，筛选出1株胆固醇降

解率为69．2％的益生菌菌株S一59，不仅具有良好的

耐酸能力和耐胆盐能力，而且具有较强的疏水性。

(3)经形态学、生理生化试验，将益生菌菌株

S一59鉴定为嗜酸乳杆菌。

参考文献：

[1】 李呢．降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机理研究【D】．

厦门：集美大学，2012．

【2】 王春光，张雪，李达，等．酸菜来源植物乳杆菌的分离

鉴定与耐受性研究叨．食品科技，2010(10)：35—38．

【3】 靳志强，王延祥，李平兰，等．植物乳杆菌耐酸耐胆盐

的体外试验及其降胆固醇作用【J】．中国食品学报，

2009，9(5)：24—28．

【4】 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所．GB厂I'

5009．128--2003，食品中胆固醇的测定[S】．北京：中

国标准出版社，2004．

【5] 杜连群．工业微生物学实验技术【M】．天