小编近期在研读百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb,BMS)研究的一款抗HIV前药BMS-663068。通读关于该药的研究报道，不得不感慨：工艺为王！无论是做什么合成研究，只有通过了工艺研究与优化，才能够安全、高效、经济、环保地生产，才能够具备强大的竞争力。BMS-663068从获得先导化合物到完成结构优化，历时将近20年，这也可以看出一个新药上市的不容易，其背后凝聚了无数人员的心血，需要的不仅仅是一个长期的时间，还有大量的财力、物力的支撑，以及非常明确的目标导向。该化合物的研究报道实在是太精彩了，也只有通阅所有研究才有畅快淋漓之感。因此，小编将这些详细的报道进行整合，给读者朋友展示。希望大家阅读后，能够升华对工艺研究的理解与认识。如果能够因此指导自己的工作、研究等，小编将感到万分荣幸。第一期(本期)，综述研发历史、研发路线与生产路线的优化；
早在2000年，百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb,BMS)的研究人员获得了最初的先导化合物。进一步研究，在2003年对吲哚的苯环进行生物等电体修饰（N代替CH），并且引入甲氧基，得到命名为BMS-378806的分子。随后又再次对吡啶环进行修饰（2009年，BMS-448043），引入甲基三氮唑基团（2012年，BMS-626529）。但是BMS-626529溶解度差，生物利用度低，这也就导致了该化合物的生理药理活性没有得到充分利用。最后，研究人员进一步对该化合物结构进行研究，在吡咯环的氮上引入磷酸亚甲基，由此产生的膦氧甲基前药BMS-663068极大地改善了溶解度特性，解决了与母体分子相关的生物利用度挑战，并被指定为该项目（抗HIV）的主要活性药物成分(API)。从上述抗HIV前药BMS-663068的研发历程，我们就可以简单体会到研发一款新药的不容易。单论时间投入这一项，其投入程度就不是一般的公司与个人可以承担的。
药物化学路线
HIV-1进入人体是一个复杂的多步骤过程，包括病毒gp120包膜糖肽和宿主细胞CD4受体之间的相互作用，然后是协同受体结合和膜融合。迄今为止，已批准的治疗HIV感染的疗法分为四大类:(1)进入抑制剂，(2)逆转录酶抑制剂，(3)整合酶抑制剂，和(4)蛋白酶抑制剂。两种抗逆转录病毒药物maraviroc和enfuvirtide分别通过阻止HIV-1与CCR5协同受体结合和抑制gp41介导的融合抑制病毒进入，但目前尚无批准的药物可以抑制CD4和gp120的初始结合。BMS-488043(1)经过附着抑制剂验证，首次实现了该目标。在后续优化工作导致更有效的BMS- 626529(2)的发现，由于化合物2溶解度低和半衰期短，前药BMS-663068(3)被选为活性药物成分(API)。在开始研发阶段，研究人员也开发了两条药物合成路线用于探索研究，合成示意图如下图所示：
两条路线均经过一个6-N-杂吲哚中间体7的过程，如下图所示：
路线一，以2-氯-3-硝基-5-溴吡啶5开始，经过一个低收率的Bartoli吲哚环化反应、随后通过铜(I)催化甲氧基化，以大约10%两步收率制备得到二甲氧基氮杂吲哚7。路线二，从2-氨基-3-硝基甲基吡啶化合物8开始，依次经过溴化(96%)，重氮化/甲氧基化(44%)，分步的Leimgruber−Batcho吲哚合成，铜催化甲氧基化，最终以29%的总收率制备氮杂吲哚化合物7。
合成探索路线在获得盐酸盐7B后，选择性水解C7的甲氧基并使用三氯化磷进行氯化（两步收率≈64%），随后通过熔融作用引入甲基三氮唑（55%），接着依次进行Freidel-Crafts酰基化（74%）、酰胺化（83%），最后发生烷基化（70%），叔丁酯基溶剂解离、三羟甲基胺基甲烷盐形式分离。最终，从2-氨基-3-硝基甲基吡啶8出发，药物化学合成共12步，总收率为不到5%（约3-4%）。
吨级制备路线的开发
但是，为了支持抗HIV临床研究和进一步的临床验证，百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb，BMS)的研究人员开发了三代制备BMS-663068的生产路线，总共生产了将近一吨API。合成概览如下示意图所示：
药物化学合成路线的挑战：特别是8到11的长线性步骤，使用POCl3溶剂制备11，和涉及熔融的三唑引入。研究人员使用药化合成路线完成了最初的100公斤交付。
对于甲基三氮唑-6-氮吲哚骨架的构建，合理的断裂策略有三种：1）三取代或四取代吡啶的活化或环解；2） C(7)活化；3）4-溴-6-氮吲哚底物的羟基化或甲氧基化。然而不幸的是，这些方法都没有获得成功。
由于项目的时间限制，在认识到挑战的同时，研发人员决定基本遵循药物化学路线，完成前100公斤的交付制备。
第一阶段：氮杂吲哚环的制备
鉴于2-氨基-3-硝基甲基吡啶8的商业可用性限制，转而从2-氨基-4-甲基吡啶17开始。依次经过N-乙酰化、溴化和剧烈放热的硝化反应，以良好的收率制备得到胺18；使用t-BuONO进行Sandmeyer甲氧基化，获得明显的收率提升（从44%提高至77%），同时生成的副产物20(≈15%)在重结晶过程可以除去；为了提高收率，开发了亚硝酸钠原位生成HCl的方法：结果避免了生成20的可能性，尽管最初生成了高达25%的19，但使用NaOAc/NaOMe进行处理可以将这种中间体高产率地转化为预期的产品。研究发现，无需加入甲醇锂(LiOMe)催化，只需要用DMF·DMA在80 °C即可将9高效地转化为10。制备二甲氧基21时，保持温度低于零度是关键( <0 °C时收率达到80%，>10 °C时产率下降至50-65%)，主要副产物为脱溴化合物22，可以通过重结晶过程除去。硝基还原吲哚环化过程，主要研究使用略便宜的Pd/C代替Pt/C，在高温条件下进行转移氢化过程。在条件A情况下，最关键的参数是甲酸-四氢呋喃溶液滴加至50 °C混合了化合物21、Pd/C、THF-EtOH-Et3N的速度：最优产率需要控制在45 min滴加完成。如果滴加速度快了，则双氢化的胺24增加；滴加速度放慢，则导致N-羟基化合物23增多。当然，经过适宜的后处理，可以顺利获得高纯度的盐酸盐7B。条件B，在高压(1.8 bar)条件下，100 kg规模转移氢化过程顺利，分离产率略有提升（从80%提升至88%）。
由于具备了大规模制备7B的条件，进一步的挑战是开发C(7)位可规模化引入三氮唑。但是无法避免使用三氯化磷(POCl3)进行氯化，因此尝试将去甲基化、氯化结合成一个单一的转变过程。结果关键问题变成了中间体26这个盐化合物的分离与处理：26储藏时间超过12小时就无法保持可流动固体状态，为了防止生成PO(OMe)3导致盐酸盐11液态化，必须严格除去残留的三氯化磷(POCl3)。下一步，为了避免在110-120 °C熔融状态引入甲基三氮唑12。研究人员尝试了过渡金属催化转化方法，但是没有找到合适的。后来发现，在4-甲基-2-戊醇中回流条件下，以中等重结晶收率(51%)获得纯度大于99%的三氮唑吲哚衍生物13。研究人员尝试提高合成路线的汇聚性，一开始尝试使用连接了哌嗪环的侧链酰氯或羧酸酯，希望在路易斯酸、碱或者离子液体等条件发生直接的偶联反应；结果，酰氯类型底物仅50%转化率，而羧酸酯不反应。接着尝试，先与草酰氯发生Freidel-Crafts酰基化，接着再和哌嗪环进行酰胺化，可以55%收率引入相应侧链；但是需要大于5个当量的草酰氯以防止生成的酰氯发生过度反应，在酰胺化步骤又需要通过蒸馏除去过量的草酰氯，这样的条件与不利操作成为了限制。13到14的初始转化的关键问题是要求控制−45 ℃低温反应条件。研究人员在酰基化过程中，发现了关键的几点：1）相对于锂、钠、锌，镁具有独特效果，使用异丙基氯化镁(i-PrMgCl)反应最干净；2）14比13更具酸性，因此需要>2倍量的碱；3）氘代试验表明，加入两个当量的异丙基氯化镁(i-PrMgCl)，生成双阴离子35；4）吡啶显著加速酰化的速率，但不影响金属化的结果；5）改变加料次序：将双阴离子滴加到甲基戊酰氯的甲基四氢呋喃溶液中，可以极大地减小酰基化过程的放热，同时反应可以在 -25至-10 ℃之间良好进行。经过这些优化，最终化合物14重结晶分离收率达到76%。在药物化学合成研究中，使用叔丁醇钠将哌嗪15与化合物14转化到2的制备过程，观察到明显到水解生成羧酸34到现象。为此，开发了一个两阶段的流程：羧酸甲酯14在NMP/H2O中使用三当量叔丁醇钾(t-BuOK)处理生成羧酸34，随后在EDAC存在下与哌嗪15A缩合，两步收率77%制备关键中间体2。中间体2存在的挑战问题是：分离。经过大量的试验，包括增加了两个热循环，由于化合物2非常低的溶解度和针状的形态（见下图），过滤过程极其缓慢；在26公斤的规模使用两个Nutsche过滤器同时过来，过滤需要>2周！尽管如此，该工艺仍成功地制备了159公斤纯度为99.9%的化合物2。
第四阶段：目标分子3的制备
目标分子3的合成包括对2进行烷基化，以及去保护和成TRIS盐化。片段16依据之前报道优化的方法，以48%的制备产率完成44 kg。同样的，烷基化过程也基本维持药物化学合成路线的条件。生产上主要改变的几点在于：1) 中间体2与NMP混合加热至90 ℃使其全溶；2) 通过反应器底部阀门利用氮气连续鼓泡，以保持Cs2CO3维持悬浮液状态；3) 开发一种改进的MTBE:DCM (4:1/v:v)抗溶剂添加方案，以提高过滤速度，相比原来的DCM到IPA蒸馏结晶过程。与药物化学路线相似，在50 ℃的丙酮/水中溶解37。尽管在API步骤中产量低于预期，但整个过程提供了108公斤纯度>99.6%的BMS-663068 (3)。
第二代生产路线：218 kg
完成100公斤交付后，研发人员有充足时间进行第二代生成路线的研发。优化工作的重点是确定替代C(3)侧链和前药物安装策略。为此，需要达到几点：1）避免使用中间体16(鉴于其合成原料来源受限，以及合成收率低)；2）鉴于中间体2过滤困难，开发无需分离的过程；3）保持37中间体的分离，作为质控阀门。研究设想策略是，以底物14出发：(1)N(1)烷基化，(2)苯甲酰哌嗪侧链安装，(3)N(1)取代基转化为卤代乙基衍生物，(4)与二叔丁基磷酸钾反应，以制备关键中间体37。
首先，实现了中间体2与氯甲基乙酸酯或4-氯苯基氯甲基硫醚进行制备的两条路径。乙酸酯40唯有B-溴甲基氯甲基酯可以有效地进行溴化，制备溴化物41；随后经二叔丁基磷酸钾处理，两步收率84%制备37。第二条路径，硫醚衍生物43与氯气经过直接滴加过程瞬间完成反应，以中等产率(70-75%)制备氯代烃盐酸盐44A，同样经二叔丁基磷酸钾处理高效制备37。
尽管两条路径都很有效，但是都是从非期望都中间体2出发，无法通过2将化合物14转化为40或43，因此必须在酰胺化之前发生N1烷基化。由于乙酸酯片段45在多种酰胺化条件下均不稳定，因此，随后选择硫醚进行进一步研究。
在基本断键策略指导下，筛选了多种溶剂、碱和添加剂。氯甲基硫醚46在Finkelstein条件使用化学计量的NaI处理转化为碘甲基硫醚47，接着与14在含有四甲基胍的NMP中反应，生成48:49(4:1)的混合物。研究发现，通过稀盐酸洗无法除尽49；随后优化后处理方案为：加入15 L/kg乙酸乙酯，依次经0.5 M盐酸洗涤三次，水洗两次。后续也证明，必须经过水相洗涤5次，以确保在重结晶之前除去NMP和副产物49。将溶剂乙酸乙酯更换为异丙醇进行重结晶，最终以>97.7%纯度125 kg制备48。
随后，进行酰胺化研究：发现除了期望产物43，还有还原物50与酯交换化合物生成。经过条件探索，发现市售的钛酸四丁酯不仅反应速率快，而且期望化合物43收率高，同时原料转化率高，副产物较少。
由于使用到钛，接下来研究后处理与分离操作，以尽可能降低重金属Ti的含量。MeTHF反应体系与NaHSO4 (1 M)混合，随后加入EtOH:heptane(1:1)作为抗溶剂，最终获得的期望硫醚43含钛量低于10 ppm。
总的来说，最后的合并程序包括:1）15A在MeTHF中用NaOH游离，共沸蒸馏；2）由于15B产率变化存在范围(75-99%)，需要测定含量，以保证1.3个当量投料比；3）随后加入48和钛酸四丁酯，加热回流。反应完成后，冷却至65 °C，加入晶种，缓慢降温至15 °C。经过这样的过程，100-122 kg规模，可以>99.6%纯度82-84%收率获得<10 ppm Ti的酰胺硫醚43。继续合成，目标转移至优化硫醚43转化至氯甲基44：
在第二代生成路线中，通过小心地通入氯气，以最大限度地减少过氯化；随后加入丙酮与异丙醇淬灭51，同时分离盐酸盐44A；湿饼状态转移至二氯甲烷和水中，无需额外加入碱，更换溶剂至乙酸乙酯，即可分离得到氯甲基44B(115-120 kg，80-84% yield， 97-98% purity)。
氯化物44B使用二叔丁基磷酸钾取代氯即可完成全合成。相转移催化剂(PTC)影响到反应到速率和转化率等（Table 1）。结果发现反应速率与阴离子(Cl < Br < I)以及烷基链长度 (ethyl < propyl < butyl)有关系，使用四甲基相转移催化剂则几乎没有发生转化。最后，选择Et4NBr作为PTC，以98%纯度，82-86收率77 kg规模制备得到关键化合物37。
第二代生产路线中，在制备API步骤没有大的改变，由于化合物37的改进和更一致的纯度，在过滤与分离过程没有明显的收率下降，最终以83-94%收率生产218 kg目标化合物BMS-663068 (3)。
进一步优化的目标，需要更有效地解决烷基化、酰胺化和氯化过程。吲哚14至硫醚48的转化为研究起点，优化集中在开发一个改进的流程来解决三个问题：使用NaI的混合敏感芬克尔斯坦(Finkelstein)反应的分离条件;对4-氯苯氯甲基硫化物(46)大量过剩(1.7 equiv)的需求;以及多重挑战性的相分离。研究发现，使用碳酸钾和乙腈代替TMG和NMP，在催化量的四丁基碘化铵(TBAI)存在下，可以一锅法制备48（同样的，48:49≈4:1），通过该优化方法制备了大于1000 kg。
第三代生产路线，酰胺化的目标在于：1）降低游离碱15A的生成量；2）使用便宜的溶剂代替甲基四氢呋喃(MeTHF)。第二个目标使用甲苯作为溶剂实现。但是甲苯/氢氧化钠水溶液无法避免游离碱15A的问题，后来发现在乙腈中使用0.95 equiv碳酸钾，然后更换甲苯进行共沸，再通过过滤，即可以大于96%收率制备15B。最终以82-84%收率>99纯度并且<10 ppm Ti制备了1200 kg酰胺43。
寻求一个缩合过程将酰胺43转化为磷酸酯37。基于标准的氯化条件，使用异丙醇淬灭51，再经过两次水洗、共沸蒸馏，获得粗品44B。在0.5当量四乙基溴化铵存在下，与磷酸钾42直接发生加成反应，再经过第二代生产路线同样的水洗、重结晶操作，以97%纯度73-78%收率获得37。
最后，水解脱去二叔丁基，转化为TRIS盐，获得720 kg符合纯度要求的API(3)。抗HIV前药BMS-663068无论是从其发现历史，还是药物合成路线到生产路线的不断优化，都是一个非常精彩的故事，值得深入阅读。
参考
J. Org. Chem. 2014, 79, 18, 8757–8767
J. Med. Chem. 2018, 61, 1, 62–80
Org. Process Res. Dev. 2017, 21, 1095−1109
Org. Process Res. Dev. 2017, 21, 8, 1095–1109
