单细胞RNA测序技术回顾(一):Smart

传统的基因表达研究,从芯片到RNA测序,无不依靠数百万个细胞才能开展。然而,考虑到细胞群体的异质性,这种简单的平均值当然无法满足科学家的需求。不同类型的细胞采用独特的基因组合来表达蛋白质,即使是同一类型的细胞,转录组也是高度变化的。

于是,科学家开始探索单细胞RNA测序技术。从样本制备到数据处理,处处是难题。单细胞的分离和处理以及扩增时灵敏度和偏向性的技术问题都增添了复杂度。好在,各种技术都在不断发展。自2009年汤富酬等人首次报道单细胞RNA测序技术以来,许多新颖的技术被开发出来,可以更快速、更低成本地提供更多信息。这将大大增加我们对细胞的了解。

在此,我们将回顾一些重要的单细胞RNA测序技术。

Smart-Seq

Smart-Seq(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)是一项具里程碑意义的技术,在2012年由美国和瑞典的科学家共同开发。作为一种单细胞测序方案,它在转录本的序列覆盖度上有所改善。基因组的完整覆盖实现了选择性转录本异构体和SNV的检测。

在这种方案中,人们裂解细胞,并将RNA与包含oligo(dT)的引物杂交。然后添加几个无模板的C核苷酸,生成第一条链。这种poly(C)垂悬只添加到全长转录本上。然后将寡核苷酸引物与poly(C)突出杂交,合成第二条链。全长cDNA经过PCR扩增,以获得纳克级的DNA。PCR产物纯化后可用于测序。

优点:
1. 不需要知道mRNA的序列。
2. 使用低至50 pg的起始材料。
3. 转录本的覆盖度改善。
4. 高水平的可定位序列。

缺点:
1. 并非链特异的。
2. 转录本长度偏向性,对超过4 Kb的序列不能高效转录。
3. 高丰度转录本被优先扩增。
4. 纯化步骤可能导致材料损失。

Smart-Seq2

Smart-Seq2一年后发表在《Nature Methods》上,对最初的Smart-Seq方案做了一些改进。新方案使用锁核酸(LNA)、更高浓度的MgCl2以及甜菜碱。它不再需要纯化步骤,可大大提高产量。

在这个方案中,人们在包含游离dNTP和带有通用5’ 锚定序列的oligo(dT)寡核苷酸的缓冲液中裂解单细胞。之后开展逆转录,这个反应也在cDNA的3’端添加2-5个无模板的C核苷酸。然后加入模板转换寡核苷酸(TSO),它携带了两个核糖鸟苷和一个修饰鸟苷,在3’端产生LNA,作为最后一个碱基。在第一链反应后,利用有限的循环扩增cDNA。然后通过Tagmentation,利用扩增出的cDNA快速有效地构建测序文库。

优点:
1. 使用低至50 pg的起始材料。
2. 不需要知道mRNA的序列。
3. 不再需要纯化步骤。
4. 转录本的覆盖度改善。
5. 高水平的可定位序列。

缺点:
1. 并非链特异的。
2. 只测序poly(A)+ RNA。

这些方案利用现成的试剂,让研究人员能够更低成本、更大规模地开展复杂的单细胞分析。它的组分和原理向大家公开,让研究人员可进一步对其进行改良。在此之后,许多单细胞测序的新成果涌现。

当然,你也可以借助商业化的系统来更高效地完成工作。Fluidigm C1单细胞制备系统能够自动完成Smart-seq操作。你只需要将制备好的细胞悬液加进去,仪器就会分离并裂解细胞,把mRNA逆转录为cDNA,然后对cDNA进行扩增。扩增后的cDNA可以拿来测序,也可以进行qPCR检测。(生物通 余亮)

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