文献解读 | CIRC-AKT 3通过改变miR-296-3p/E-cadherin信号抑制肾透明细胞癌转移
论文：Circ-AKT3 inhibits clear cell renal cell carcinoma metastasis via altering miR-296-3p/E-cadherin signals（CIRC-AKT 3通过改变miR-296-3p/E-cadherin信号抑制肾透明细胞癌转移）
背景
MiRNAs是一种小的非编码RNA，也负责mRNA功能的调控，许多miRNAs在肾癌的发展过程中起着关键作用。
MiRNAs与参与转移性肾细胞癌的圆环RNA之间的特异性相互作用尚未得到充分讨论，因此，深入了解miRNAs及其潜在的转录调控因子在肾转移过程中的作用可能有助于阐明ccRCC的发病机制。
新出现的证据表明肿瘤侵袭性与上皮间充质转换(EMT)有关。EMT促进癌细胞的成瘤进程，增加细胞迁移和侵袭，“干细胞”，抑制细胞凋亡和衰老。EMT的特点是细胞粘附连接功能的丧失。
粘附连接主要由一种跨膜钙依赖性糖蛋白E-cadherin(基因ID：cdh 1)组成，它在细胞的机械偶联中起重要作用，从而在局部和组织水平上保持完整性。
此外，E-cadherin还通过其细胞质结构域与catenin家族的相互作用参与调节细胞死亡/增殖的细胞信号。加在一起，E-cadherin被确立为一种抑癌剂，这一点也就不足为奇了。
此外，它的功能丧失与肿瘤的侵袭和转移有关。从而导致许多癌的预后不良。在ccRCC中，临床标本中经常观察到E-cadherin表达的放松管制而E-cadherin的丢失被认为是早期的致癌事件。
另一方面，E-钙粘素的恢复抑制肿瘤的进展，包括在各种体外和体内肿瘤模型中的转移。然而，在ccRCC中，miRNA和圆环RNA对E-cadherin的调控网络尚不清楚。
在本研究中，我们通过微阵列分析和qPCR阵列鉴定了一种来源于AKT 3基因位点的新的圆环RNA，称为CIRC-AKT 3，该基因在ccRCC组织和细胞系中稳定下调。
功能检测显示CIRC-AKT 3与ccRCC细胞的转移呈负相关。机理研究表明，CIRC-AKT 3可能作为miR-296-3p的海绵，上调E-cadherin的表达，从而抑制ccRCC的体外迁移、侵袭和体内转移。CIRC-AKT 3可作为抑制ccRCC转移的治疗靶点。
circRNA微阵列分析显示crRNA在透明细胞肾细胞癌中的表达谱
为了研究crcRNA在ccRCC中的表达谱，我们用Arraystar人圆环RNA阵列V2(Arraystar Human CircRNA Array V2)芯片分析了3对与癌旁正常组织配对的ccRCC组织标本。
在ccRCC组织中，共有53个cRNAs被显著上调，30个crna被下调(由cfc(折叠变化)≥2和crcRNAs过滤)。P < 0.05) ，详细列于其他档案中。这些环RNA的解除显示了它们在ccRCC进展中的潜在作用，需要进一步的研究。
CIRC-AKT 3在ccRCC细胞迁移和侵袭中的抑制作用
为了探讨CIRC-AKT 3在ccRCC中的作用，我们使用了三个siRNA寡核苷酸来定位该圆环RNA独特的背剪接连接。反义剪接连接siRNAs可显著降低CIRC-AKT 3基因表达，而不降低AKT 3 mRNA水平。
此外，用Geneseed方法合成了过表达圆环AKT 3的慢病毒质粒，并通过qRT-PCR检测其转染效率。此外，在改变CIRC-AKT 3的表达后，AKT 3蛋白保持不变。MTT分析显示CIRC-AKT 3不影响ccRCC细胞的增殖(附加档案)。
然而，在CIRC-AKT 3基因敲除后，OSRC-2细胞表现出较强的迁移能力，如伤口愈合实验所示，反之亦然。Transwell法进一步证明，CIRC-AKT 3的沉默显著促进了OSRC-2细胞的迁移和侵袭，其中含有较高内源性CIRC-AKT 3。
同时，CIRC-AKT 3的过表达明显抑制内源性CIRC-AKT 3细胞的迁移和侵袭能力。(f-h)加在一起，结果如图所示。C-h显示，CIRC-AKT 3通过抑制ccRCC细胞的迁移和侵袭而发挥保护作用。
CIRC-AKT 3通过恢复E-cadherin的表达抑制ccRCC的迁移和侵袭
为了检测CIRC-AKT 3在ccRCC中的作用机制，我们对某些与ccRCC转移相关的基因进行了研究，以获得一些线索。其中，E-cadherin作为一个转移相关基因，受CIRC-AKT 3的调控，如Westernblotting结果所示。
越来越多的证据表明，E-cadherin在ccRCC转移中起着关键的保护作用。有趣的是，根据对TCGA数据库的分析，E-cadherin在肿瘤组织中的mRNA水平大部分低于匹配的非肿瘤组织。
E-cadherin在ccRCC组织中的表达与CIRC-AKT 3表达水平呈正相关(P<0.05)。p < 0.005, r = 0.4004) 。这些数据提示E-cadherin在介导CIRC-AKT 3依赖性抑制ccRCC迁移和侵袭中起着关键作用。
CIRC-AKT 3的体内修复抑制ccRCC转移
进一步在体研究CIRC-AKT 3的强制表达对ccRCC转移的调节作用。将稳定表达荧光素酶(OSRC-2-荧光素酶)的OSRC-2-荧光素酶(OSRC-2-荧光素酶)细胞接种于BALB/c裸鼠肾下包膜下，经普罗霉素筛选后，将OSRC-2-荧光素酶载体细胞(OSRC-2-荧光素酶载体细胞)注射到BALB/c裸鼠肾下包膜下。
结果显示，注射CIRC-AKT 3高表达细胞(OE-CIRC-AKT 3)的裸鼠转移灶比载体组少。此外，与对照组相比，OE-CIRC-AKT 3组E-cadherin表达水平明显升高免疫组织化学染色(IHC)结果显示，与对照组相比，OE-CIRC-AKT 3肿瘤中E-cadherin的表达明显增强。这些结果表明，强制表达CIRC-AKT 3能有效地抑制ccRCC在体内的转移。
讨论
在以前的研究中，miR-296-3p被报道参与了许多癌症的转移。它是一种癌基因，促进前列腺癌的迁移和侵袭。但作为肺腺癌转移的抑制因子。然而，它在CCRCC中的作用从未被研究过。
我们确定miR-296-3p促进了ccRCC细胞的迁移和侵袭，CIRC-AKT 3可以逆转这一现象。重要的是，miR-296-3p通过与E-cadherin的3‘-UTR结合，通过荧光素酶报告分析和Westernblotting分析，证明可以降低E-cadherin的表达。
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