CRISPR-Cas9基因敲入技术原理

基因敲入技术在基因功能研究和疾病治疗等众多方面发挥着重要的作用，但是在实际的操作过程中，想获得一个纯合的KI细胞系并不是一件容易的事。因为KI细胞系构建是否成功是受到多方面因素影响的，如敲入基因片段的长短、同源重组效率、细胞系类型等均能影响编辑效率，所以这也使得KI的技术难度很高。今天让我们了解一下构建KI细胞系的原理和需要注意的细节。

在sgRNA引导下，Cas9内切酶定点切割DNA双链而产生DNA缺口，然后生物体启动同源重组修复途径，当存在一段高度同源的DNA模板（Donor DNA）时，会以Donor DNA为模板进行修复，从而达到将目的片段定点引入基因组的目的（图1）。

图1. CRISPR-Cas9基因敲入原理

在这个过程中，Cas9的切割效率、细胞双链DNA断裂后以同源重组方式进行修复的概率、以Donor模板重组的概率一同影响最终的基因编辑效率。这也是阳性克隆获得率低的原因。