这是要从能量角度来寻找氢气的生理效应吗？
生死攸关呼吸间。氢气医学也许可以从“能量医学”或“能量生物学”的角度获得灵感。4月底在大连举行的会议上，我从线粒体“能量稳态”的角度去探讨氢气抗氧化的机制，线粒体“能量稳态”可以算是我针对氢气机制提出的新概念，后续文中会详细介绍。氢气是小分子大作用，“生物酶”、“氢化酶”、“能量稳态”、“离子通道”，都是生命界的重量级选手。归根，线粒体中进行的各类生命活动的本质也是酶学反应，离子通道也是蛋白质，与生物酶同类，后边三个都可以看作“生物酶”的特例或扩展版。上一篇介绍了植物线粒体可以产生氢气，氢气是怎样在线粒体产生的？这个问题理解起来有些难度。涉及到要理解线粒体的三个基本内容：1）三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）；2）电子传递链（electron transfer chain，ETC）复合体结构的研究进展（Guo R, Cell 2017)；3）缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury）的研究进展（Chouchani E,Nature 2014）。细胞的各种生命活动都需要能量，能量多数是依靠氧气氧化有机物提供，也就是在有氧气存在时，有机物（燃料）最终被氧化为C02和H20，从结果来看这与物质的燃烧类似，但细胞内的“燃烧”却不是直接变成灰烬这种剧烈的反应，而是在严格的调控下逐步释放能量，电子最终被汇聚到通用电子受体烟酰胺核苷酸（NAD+或NADP+）、黄素核苷酸（FAD或FMN）中，形成NADH、NADPH、FADH2等形式存储和传递。线粒体被称为细胞的能量工厂。有两个重要的能量代谢过程在线粒体进行，即三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA）和基于电子传递链的氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation，OXPHOS)过程，这两个环节紧密联接，完成有机物氧化放出能量产生ATP的功能。这个过程也称为细胞的有氧呼吸作用(cellular respiration)，即细胞消耗氧气氧化有机物产生二氧化碳和能量。细胞内能量代谢可以分为线粒体外氧化，和线粒体内的TCA和ETC氧化三个阶段(图1)。第一阶段，线粒体外的糖酵解过程，也称为无氧呼吸。糖酵解是葡萄糖完全氧化过程的第一步，葡萄糖在线粒体外被氧化为丙酮酸，丙酮酸可以被还原为乳酸、乙醇或其他酵解产物。糖酵解阶段产生的能量很少。第二和第三个阶段是在线粒体内氧化，也称为有氧呼吸。第二个阶段，三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），也称柠檬酸循环。糖酵解产生的丙酮酸可以进入线粒体，氧化脱羧生成乙酰辅酶A（Acetyl-CoA)，乙酰基进入TCA循环,并在酶催化作用下被氧化为C02，氧化所释放出来的能量被汇聚到通用电子载体NADH和FADH中。其它有机燃料分子，如脂肪酸和一些氨基酸等，也可以被氧化生成乙酰辅酶A，成为以乙酰基形式存在的二碳单位，进入线粒体进一步氧化。第三阶段，氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation，OXPHOS)。还原型辅酶分子NADH和FADH被氧化，将其中的质子（H+）和电子（e）释放出来。所放出的电子经由一连串被称为呼吸链的电子载体分子（respiratory electron-transport chain，ETC）传递给最终的电子受体氧气。H+被泵出到线粒体内膜外形成电位梯度，这个电位梯度储存了大量的能量，当H+通过ATP合成酶返回的时候就可以推动ATP的合成。
图1. 蛋白质、脂肪和糖类在细胞呼吸3个阶段的代谢。阶段1:脂肪酸、葡萄糖和某些氨基酸氧化得到乙酰辅酶A；阶段2:乙酰基在三羧酸循环中经过4步被氧化脱去电子交给NADH和FADH。阶段3: NADH和FADH接受电子传递给线粒体(在细菌中连接于质膜上)的电子载体链(呼吸链),最后还原氧气生成水。电子流动驱动ATP 的生成。图据Lehninger Principles of Biochemistry 有修改。2、电子传递链（electron transfer chain，ETC）复合体结构的研究进展（Guo R, Cell 2017)真核生物线粒体的电子传递链是能量代谢的核心部位，实际是由线粒体内膜上四种酶(复合物），即NADPH-泛醌、琥珀酸-泛醌还原酶、泛醌-Cytc还原酶、Cytc氧化酶(ComplexⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组成，它们协同作用，巧妙地实现了质子和电子的分离，电子通过 CⅠ→CⅢ→CⅣ 和 CⅡ→CⅢ→CⅣ两条途径被传递给O2生成水，质子则在线粒体内膜的两侧形成电位差（换算成膜厚度可以高达每厘米120000 V），化学能变成的跨膜质子梯度，成为从生物氧化反应中获取能量的储存库。当H+从膜间隙通过“分子马达”ATP合成酶（也称复合物V，Complex Ⅴ）回到线粒体基质，驱动通用能量货币ATP的合成（Chen L B ，1988）；质子跨膜的渗透也是生物系统产热的重要来源。线粒体的跨生物膜的电化学梯度是生物系统进化出的用于储存多余的氧化还原能量的机制，也称为化学渗透机制，这成为细胞重要的能量来源，也对细胞的生理功能有重要的影响。在如何将化学能转换为生物能方面，生物系统非常精妙，单个化学反应的能量不好控制，但是当化学能转换成跨生物膜的电化学梯度，膜电位的控制弹性就大多了，电位本身的高低可以调节电子传递速率、ATP的产生和产热等能量过程，同时膜电位也是重要的生理功能调节器。近年来，线粒体研究的重要进展之一是电子传递链超级复合体结构的解析。真实的线粒体电子传递链的结构并非如图1所示成链状排列，而是构成近乎中心对称的环形结构的电子传递链超级复合物（electron transport chain supercomplex , ETCS）。2017年清华大学杨茂君教授在Cell发表人源呼吸链蛋白质超级复合物（MCⅠ2Ⅲ2Ⅳ2，17.4 Å）的高分辨率三维结构以及超级复合物（SCⅠ1Ⅲ2Ⅳ1，3.9 Å）的原子分辨率结构（Guo R，2017）。
图2. 线粒体电子传递链复合体结构。右侧图显示由 CI, CII, CIII和CIV构成的Q库（Guo R，2017)
图2展示了ETCS的结构，在这个结构中我们需要注意的几点：1）呼吸链结构MCI2Ⅲ2IV2(2个CI、2个CⅢ和2个CIV)形成近乎中心对称的环形结构的巨复合物（megacomplex），CⅢ二聚体位于中心，它被两个CI和两个CIV包围。计算推测CⅡ可以插入CI和CIV之间的间隙，形成一个封闭的环(Q池），CI 和 CⅡ在物理空间上相邻。因而，呼吸链中四个电子传递链蛋白组合成一个更大的电子传递链超复合体Ⅰ2Ⅱ2Ⅲ2Ⅳ2从而可以更高效的发挥功能。2）辅酶Q是在复合物间传递电子的载体，由CI、CII、CIII和CIV密封形成Q池，在ETCS中，CI和CII可以使用相同的Q池，使得电子的传输途径更有效。这也是理解缺血再灌注损伤和线粒体产生氢气的关键点之一。3、 缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury）机理的研究进展（Chouchani E,Nature 2014）缺血和再灌注引起的组织损伤可增加多种疾病的发病率和死亡率，包括心肌梗死、缺血性中风、急性肾损伤、创伤、烧伤、睡眠呼吸暂停、冻伤和血栓等血液循环障碍等，缺血再灌注损伤也是器官移植、心胸外科、血管外科和普通外科面临的主要挑战。缺血再灌注损伤是医学上一个非常重要的专业名词，核心是由线粒体引发的过量活性氧自由基（ reactive oxygen species，ROS）造成的氧化损伤，理解了它可以对很多疾病的底层逻辑有更准确的把握，也更能理解氢气抗氧化的机理和意义。缺血再灌注损伤是指组织在缺血一段时间后又突然恢复供血（即再灌注）时出现的损伤。血液是氧气进入组织的运输队，组织缺血和恢复供血对应于缺氧和供氧。前边介绍了，氧气发挥功能是要进入线粒体的，在电子传递链的末端接受电子。能量还在源源不断地运往线粒体，氧气却没有了，多出来的电子怎么办？想象一下堰塞湖，蓄水越来越多积蓄的能量愈来愈高，最后决口了，这与细胞内的缺血再灌注有点类似。2014年Chouchani等在Nature描述了细胞内由缺血再灌注造成的“堰塞湖”的形成过程（Chouchani E，2014）。常氧情况下的电子传递有两条线（图3）。一是，CI接受TCA代谢产生的NADH的电子并传给辅酶Q，再由Q把电子传递给CⅢ，最终在CⅣ电子被传递给氧气。二是电子传递起始于CⅡ，CⅡ很特殊，它本身就是琥珀酸脱氢酶，催化TCA循环中的琥珀酸发生脱氢反应变成延胡索酸，这个过程中同时把电子通过CⅡ传递给辅酶Q，再由Q把电子传递给CⅢ，最终在CⅣ电子被传递给氧气。所以CⅡ既属于三羧酸循环（TCA）又属于电子传递链（ETC），属于双跨选手。此时膜电位（Δp）处于正常状态。
图3. 线粒体在常氧和缺氧情况下的代谢。据Chouchani 等有微调（Chouchani E,2014）
缺氧情况下（图3、4），电子通过CⅢ、CⅣ传递给氧气的通路被打断，来自TCA的能量依然源源不断通过CI和CⅡ传递到ETC。当电子通过辅酶Q传递给CⅢ遇到阻碍，在CI和CⅡ之间开启了内循环模式，形成新的电子通路，琥珀酸作为电子受体。也就是CI的电子通过辅酶Q直接传递给近邻CⅡ，CⅡ接受电子后催化从延胡索酸到琥珀酸的逆反应把电子储存在琥珀酸中。此时膜电位（Δp）降低，ATP产生不足，ADP变生AMP，线粒体的能量产生受到抑制。ETCS特殊的结构使这个过程更容易理解和解释了：由CI、CII、CIII和CIV密封形成Q池，在ETCS中，CI和CII是邻居，它们使用相同的Q池向CⅢ运送电子，当CⅢ的电子通道被打断时，CI和CII之间启动内循环作为救急措施起到了保护作用。随着琥珀酸积累的愈来愈多，堰塞湖开始形成，危险越来越大。
图4. 缺血过程中琥珀酸盐的积累和再灌注过程中RET形成超氧化物的模型。Δp，质子动力。（Chouchani E,2014）
再灌注时，随着氧气的恢复，CⅡ开始快速代谢过量的琥珀酸。在再灌注的第一分钟，之前缺氧形成的AMP再生生成ADP发生延迟，质子推动ATP合成酶催化ADP形成ATP的反应由于缺少底物ADP受到限制，线粒体内膜多余的质子无法通过ATP合成酶返回线粒体基质变得超极化（膜电位变高）。这反过来阻止了由CⅡ活化产生的传递电子的还原性辅酶Q（QH2)向CⅢ传递电子。QH2和质子的过量迫使CI接受电子开启反向电子输运（reverse electron transport，RET)，通过RET将电子传给氧气产生超氧阴离子自由基（O2·-）
图5.线粒体活性氧自由基的代谢。（ Lehninger Principles of Biochemistry ）
超氧阴离子（O2·-）可以在SOD酶的作用下生成过氧化氢（H2O2)，过氧化氢又可以在CAT酶的催化下生成氧气和水，如果过氧化氢不能被及时清除可以通过与铁发生芬顿反应生成活性很强的羟自由基（·OH），氧化细胞内很多活性物质，在体内没有代谢羟自由基的酶类，因而羟自由基也被称为毒性自由基。由前边的介绍可以知道，羟自由基是整个自由基链条的最后一步，本质上是能量过剩的结果，它之前的任何步骤都会影响羟自由基的产生。如果把羟自由基比作从水管流出来的水，氢气与羟自由基直接反应清除它属于后补救，水过地皮湿，氢气在反应活性弱，数量又不占优势的情况下，能否在缺血再灌注损伤自由基爆发阶段有足够的能力清除自由基需要进一步的验证。但是氢气又确实对缺血再灌注损伤表现出强大的保护作用，我认为从自由基产生的源头也就是氢气在ETCS干预自由基的产生效率会更高，这相当于关掉了自由基爆发的阀门。这个观点的证明是有难度的，这也是我们研究线粒体氢代谢（产生和利用氢气）的原因。因为一旦证明氢气与线粒体的ETCS有关系，氢气与自由基产生相关的证明就前进了一大步。上一篇我们把植物种子萌发过程中产生氢气初步定位到了线粒体，这有什么意义？种子萌发过程是一个脱胎换骨的质变过程，种子中储存了大量的能量，在萌发过程中会集中释放出来供发芽生长用，大量的能量集中在线粒体会产生氧化压力，一般讲这个过程中会有热产生，这是释放能量压力的一种方式。氢气的产生是否有同样的功能？当有大量能量集中到线粒体，电子传递加快，膜电位升高，耗氧增加，体系处于缺氧状态。可以推论，此时在缺氧的情况下植物的线粒体也会发生琥珀酸接受电子形成堰塞湖的情况，当积累到一定程度，即使没有氧气，QH2和质子的过量也会迫使CI接受电子开启反向电子输运（RET)，这时质子和电子结合形成氢气正可以释放这种能量压力。上一篇种子萌发过程中线粒体产生氢气有以下几个实验结果：1）线粒体内膜的质子梯度影响产氢能力，抑制膜电位的抑制剂可以减少产氢：线粒体CI的抑制剂鱼藤酮（Rotenone）、CIV抑制剂NaN3、解耦联剂FCCP几乎完全抑制了线粒体产氢能力，CII抑制剂丙二酸抑制约18%的产氢活性，CIII抑制剂抗霉素A的产氢抑制率为42%，而加入ATP合酶（CV）的抑制剂Oligomycin则促进了线粒体产氢。表明阻止质子泵出或破坏内膜两侧质子电化学梯度的，都会抑制产氢。Oligomycin阻止质子回流到基质，维持线粒体膜两侧较高的质子梯度可以促进产氢。 产氢反应体系中的pH逐渐降低，表明氢气产生可能需要内膜两侧质子梯度的形成，进一步表明一定的质子梯度是产氢的条件。3）TCA代谢物的变化与产氢与相关，琥珀酸的量在大量产氢前后可以相差近百倍；4）氧化型辅酶Q的加入抑制了线粒体的产氢能力，这代表了Q库容纳电子的能力增加，可以接受更多的电子。
图6. ETC抑制剂和辅酶Q对产氢的影响。Mixed acid: 5mM pyruvate+5mM malate+5mM α-ketoglutarate+10mM succinate+5mM fumarate. ns, no-significant, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, ****P＜0.0001.（Zhang X.,2020）
这些结果提示了种子萌发过程中与动物细胞缺血过程类似的代谢变化，也就是TCA循环逆行，琥珀酸作为末端电子受体大量积累。为了进一步验证这一点，我们在反应体系中补加TCA循环的中间物测定对产氢的影响，结果发现可以促进氢气的产生（图6、7）。由于线粒体产氢前会经历一段时间的静默期，为了了解在这段时间代谢过程的变化与产氢的关系，我们测定了不同时间点TCA主要中间代谢物的变化（图7）。
图7.产氢过程TCA代谢物的变化。（Zhang X.,2020）
产氢（图7D）：可以分成三个阶段，1）预备期（Ⅰ期），此时为正常线粒体代谢或缺氧的早期，没有氢气产生；2）启动期（Ⅱ期），此时有少量氢气产生；3）爆发期（Ⅲ期），大量氢气产生的阶段。琥珀酸（图7G）：对应于产氢的三个阶段，琥珀酸的量与氢气的产量对应，随着氢气产生的增加，在大量产氢阶段Ⅲ可以比预备期Ⅰ期高出近百倍，这再一次验证了氢气的产生与琥珀酸的积累密切相关。α-酮戊二酸（图7F）：对应于产氢的三个阶段，α-酮戊二酸的量与产氢有关，但量的增加比琥珀酸有延迟，由于在TCA中，α-酮戊二酸可以直接氧化变成琥珀酸，而在逆向TCA中，α-酮戊二酸可以逆行经苹果酸、延胡索酸产生琥珀酸（图7A），是代谢转换的重要节点。延胡索酸和苹果酸（图7H和I)：这两种酸在产氢的预备期开始增加，早于琥珀酸的积累，之后基本保持稳定，表明在缺氧的早期TCA逆行的代谢可能存在，以提供延胡索酸作为反应底物参与CⅡ催化的延胡索酸到琥珀酸的反应。以上结果表明氢气的产生确实与TCA代谢紧密相连，与缺氧条件下线粒体的代谢非常像。近年来，越来越多的证据表明CI中有两个辅酶Q（UQ）的结合位点(Haapanen, 2019）。 第一个UQ接受电子（UQ.-）后作为强还原剂，驱动在第二个UQ结合位点（Q2nd）的UQ还原形成UQH2，然后UQH2离开CI的Q2nd将电子传递出去（Haapanen，2018）。鱼藤酮是CI的抑制剂，研究表明鱼藤酮可以完全抑制氢气的产生，鱼藤酮的主要作用位点是抑制UQ结合CI的Q2nd位点接受电子，表明UQ结合位点对于氢气的产生非常重要。基于这些结果，我们提出了植物线粒体产氢的三阶段机制（图8）：
图8.线粒体产氢机制示意图（Zhang X.,2020）
产氢（图7D）：可以分成三个阶段，1）预备期（Ⅰ期），此时为正常线粒体代谢或缺氧的早期，没有氢气产生；2）启动期（Ⅱ期），此时有少量氢气产生；3）爆发期（Ⅲ期），大量氢气产生的阶段。1. 预备期（Ⅰ期，图8C），此时为正常线粒体代谢或缺氧的早期，没有氢气产生。TCA循环正常运行，α-酮戊二酸被氧化为琥珀酸，来自NADH的电子沿着CI的FeS簇转移到N2位点，传递给 Q1st（产生UQ.-的第一个UQ结合位点）和Q2nd （产生UQH2的第二个UQ结合位点）形成UQH2，此时不产生氢气。2. 启动期（Ⅱ期，图8D），此时缺氧有一段时间，有少量氢气产生。随着缺氧的出现和进展，电子通过CⅢ、CⅣ传递给氧气的通路被抑制，CI和CⅡ催化的电子传递至CⅢ的常规通路被抑制，在CI和CⅡ之间开启了内循环模式。琥珀酸作为末端电子受体，CI的电子通过辅酶Q直接传递给CⅡ，CⅡ接受电子后催化从延胡索酸到琥珀酸的逆反应把电子储存在琥珀酸中。TCA逆反应开始，延胡索酸在产氢的预备期开始增加，早于琥珀酸的积累，作为反应底物参与CⅡ催化的延胡索酸到琥珀酸的逆反应。在第二阶段末期，累积的琥珀酸压力增大，CⅡ的催化反应受到反馈抑制，还原型辅酶Q（UQH2）的电子传递受抑制累积增加，氧化型辅酶Q(UQ)缺乏，CI传递到N2位点的电子无法继续传递，CI→UQ→CⅡ(琥珀酸）的通路被抑制，电子在CI的N2位点附近累积，线粒体膜两侧质子的累积达到高点，造成的结果是在CI的N2附近有电子也有质子并且缺乏可以接受电子的氧化型辅酶Q,于是电子与质子结合开始生成氢气。由于CⅡ的抑制剂丙二酸仅抑制约18%的产氢活性，氢气的产生更可能在CI而不是CⅡ。3. 在长期缺氧（Ⅲ 期，图8E）情况下产生大量氢气。随着琥珀酸的积累和还原型辅酶Q的缺乏，电子经CI→UQ→CⅡ传递给琥珀酸的通路也被抑制，TCA逆行受阻，此时CⅡ催化的琥珀酸和延胡索酸的双向反应均被抑制，从α-酮戊二酸到琥珀酸的正常的TCA循环又占主导地位，琥珀酸的量进一步增加。从乙酰辅酶A到琥珀酸可以产生三个NADH，在这个阶段测定NADH含量开始升高（图7E)进一步表明TCA逆行向正行的转化。NADH的增加还有另一种可能性，即在CI电子逆行催化NAD+还原为NADH。随着NADH/NAD+比值的增加，CI通过NADH到N2的电子传递维持较大的电动势，但由于缺少氧化型辅酶Q电子无法传递出来而停在CI，质子接受电子产生氢气，氢气的产生速度达到最大值。产生氢气的质子的供体也有可能是还原型辅酶Q（UQH2），氢气质子的来源还需要进一步的证据。关于线粒体产生氢气的上述研究尚有几个问题需要进一步完善：1）线粒体产氢阶段质子的来源：同位素示踪可以最终确定。2）产氢阶段还原型辅酶Q（UQH2）的状态需要测定。3）TCA在产氢不同阶段的正行和逆行状态需要通过标记后的代谢流研究进行确证。在本研究中我们提供了线粒体产生氢气的初步证据，并对线粒体产生氢气的机理进行了初步探讨。这个研究还有很多方面需要完善，因为各种原因有些停滞，希望不久的将来能够开启下一步的工作。
参考文献
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Haapanen, O., & Sharma, V. (2018). A modeling and simulation perspective on the mechanism and function of respiratory complex I. Biochim Biophys Acta Bioenerg, 1859(7), 510-523. doi:10.1016/j.bbabio.2018.04.001 线粒体复合物I的辅酶Q结合位点
