科研 | 郑州大学：整合代谢组学和转录组学分析揭示豇豆豆荚中花青素和其他类黄酮积累的分子机制（国人佳作）
编译：微科盟 伊一，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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豇豆是豆科重要的蔬菜作物，因其豆荚嫩、口感好、营养丰富而被广泛种植。紫色豇豆豆荚吸引了更多的关注，主要是因为它醒目的颜色和有益健康的成分。最初，采用超高效液相色谱-四极杆轨道阱高分辨率质谱联用技术从紫豇豆豆荚中分离鉴定出大量的两种主要花青素(翠雀花素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素3-O-葡萄糖苷)和9种黄酮类化合物(大部分是槲皮素基黄酮醇苷)。为了对其进行系统研究，本研究采用代谢组学和转录组学相结合的方法，对花青素积累差异较大的两个代表性豇豆品种进行了进一步分析。共鉴定出56个差异积累代谢物和4142个差异表达基因。在综合分析多组数据的基础上，发现VuMYB90-1、VuMYB90-2、VuMYB90-3、VuCPC、VuMYB4和内源bHLH和WD40蛋白通过转录调控紫豇豆荚果结构基因协调控制花色素苷和类黄酮的积累。
论文ID
原名：Integrated Metabolomics and Transcriptomics Analyses Reveal the Molecular Mechanisms Underlying the Accumulation of Anthocyanins and Other Flavonoids in Cowpea Pod (Vigna unguiculata L.)
译名：整合代谢组学和转录组学分析揭示豇豆豆荚中花青素和其他类黄酮积累的分子机制
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2020年7月
通讯作者：张彦杰
通讯作者单位：郑州大学农学院
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c01851
实验设计
结果和讨论
1 绿色和紫色豇豆品种的表型分析
与绿色缸豆（“中国淡绿色”）相比，紫色缸豆（“中国红面条”）在除衰老阶段之外的大多数发育阶段豆荚皮上显示出强烈的紫色色素(图1A，B)。除表皮颜色外，“中国红面条”和“中国淡绿色”豇豆的长荚之间没有观察到显著的形态差异。此外，两种豇豆的叶色和花色相似(图1A)。由于豇豆豆荚中的紫色色素是水溶性的，因此推测紫色豇豆的着色可能是由花青素积累引起的。为了研究这些引人注目的紫色色素的积累，研究者选择了豆荚颜色明显的两个代表性豇豆品种进行进一步研究。
图1.紫豇豆豆荚花色苷的成分分析。（A）紫色豇豆品种(中国红面条)和（B）绿色豇豆品种(中国淡绿色豇豆)的表型。（C）两个不同豇豆品种豆荚皮花色苷的UHPLC图谱。用四极轨道HRMS验证的翠雀花素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素3-O-葡萄糖苷的主要裂解位点用虚线箭头表示。
2 豇豆豆荚花青素的鉴定和定量
采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法，对紫色缸豆和绿色缸豆未成熟荚(开花后7 d)的总黄酮提取物进行了详细分析。由于花青素通常在紫外-可见区吸收可见光，因此用于鉴定和定量的波长在510-535nm的范围内。通过对从两个不同豇豆品种的豆荚皮中提取的总黄酮进行UHPLC分析，检测波长为535纳米，在色谱图中标记了两个指示潜在花色素苷的主要峰(图1C)。这些花青素的鉴定是通过将紫外可见光谱、洗脱曲线、前体和产物离子与标准和文献报道进行比较来完成的。因此，在紫色豇豆豆荚中鉴定出两种主要的花青素(分别参照图1C中的峰1和峰2的翠雀花素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素3-葡萄糖苷)(图1C和表1)。
表1 .不同豇豆品种荚中花青素含量(mg/g鲜重)(n = 3）
紫嫩豆荚中花青素的总含量为4.09 mg/g(鲜重)，与蓝莓和黑莓中报道的含量相当。矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量占绝对百分比(4.03 mg/g)，而翠雀花素3-O-葡萄糖苷仅在小规模合成(0.06 mg/g)。相反，在绿色豇豆的豆荚提取物中，在535纳米的波长处没有检测到明显的光吸收信号(图1 C所示的UHPLC曲线)。显然，豇豆豆荚中的紫色色素主要来源于矢车菊素3-O-葡萄糖苷的积累,这些结果表明豇豆花色素苷的积累依赖于一个遗传成分。在以前的研究中，翠雀花素3-O-葡萄糖苷在各种豇豆品种的种皮中总是占总花色苷的最大比例，矢车菊素3-O-葡萄糖苷位居第二。由于翠雀花素3-O-葡萄糖苷在分子骨架的B环上比矢车菊素3-O-葡萄糖苷具有更高的羟基化程度，因此很明显，相同的花青素生物合成途径可能导致在不同的豇豆组织中产生不同的最终产物。然而，在豇豆种子和豆荚中检测到的所有花色素苷在C3位置都是糖基化的，这表明豇豆中花色素苷配基具有共同的修饰模式。
图2.UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法分析两个不同豇豆品种豆荚中提取的黄酮类化合物。槲皮素-3-O-半乳糖苷-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3，7-O-二葡萄糖苷的主要切割位点由四极轨道HRMS验证，用虚线箭头表示。
3 豇豆豆荚中其他黄酮类化合物的鉴定和定量
与花青素类似，黄酮类化合物的其他亚类(如黄酮醇)也起生物活性抗氧化剂的作用，以防止植物和哺乳动物细胞中紫外线辐射和其他胁迫的潜在损害。由于分子结构中的B环，黄酮类化合物的紫外-可见光谱显示在300-550nm范围内的最大光吸收。特别是，黄酮醇和黄酮的光谱显示出显著的吸收峰，命名为带1(300-380nm)和带2(240-280nm)。据认为，肉桂酰基和苯甲酰基系统分别负责吸收带一和带二。在大多数情况下，特定分析物的红移或浅红移可用于识别取代基团的类型和位置。如图2所示，在360nm波长处的表观吸收峰表明色谱图中对潜在的黄酮类化合物进行了编号。根据准确的质谱数据、保留时间和紫外可见光谱与标准和文献(表2和图2)的比较，从两个豇豆品种中鉴定出9种黄酮类化合物。
分析两个豇豆品种中黄酮类成分的含量(表2)。与不含花青素的豇豆品种相比，紫豇豆品种豆荚中黄酮类化合物的总含量明显较高(2.42 mg/g鲜重)。槲皮素-3，7-O-二葡萄糖苷在总黄酮中的比例最高(超过55%)，槲皮素-3-O-半乳糖苷-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3O-接骨木苷-7-O-葡萄糖苷分别位居第二和第三。总的来说，槲皮素基黄酮醇苷占紫豇豆豆荚中所有黄酮类化合物的90%，而山奈酚杨梅素基黄酮醇苷的含量为10%。根据这些结果，可以总结出三个关于类黄酮积累的结论:(1)豇豆中的类黄酮以糖苷形式存在，类黄酮和糖类之间有糖苷键，表明类黄酮苷元可能易于降解；(2)槲皮素基黄酮醇在黄酮生物合成途径中优先合成；(3)黄酮苷元的糖基化模式比花青素苷元的糖基化模式复杂。
花青素和黄酮醇共享类黄酮代谢的大部分生物合成途径。特别地，二氢槲皮素是槲皮素和无色矢车菊素的共同直接前体。因此，在紫豇豆豆荚中，大量基于槲皮素的黄酮醇苷与基于矢车菊素的花色素苷的增加的产量同时积累是合理的。关于修饰，似乎所有这些黄酮苷元都优先在分子骨架的C环的C3位置糖基化。然而，黄酮醇苷元在甲环C7位或乙环C4位的糖基化也很常见。总的来说，这些结果表明紫色缸豆（“中国红面条”）的未成熟豆荚是健康人类饮食中类黄酮的重要来源。此外，紫色豆荚中花青素和类黄酮的大量产生应该是由特定的豇豆基因型引起的。
表2 .不同豇豆品种豆荚中类黄酮含量(mg/g鲜重)(n = 3)
图3.代谢组学对次生代谢物变化的分析揭示了绿色和紫色豇豆品种豆荚颜色差异的内在机制。（A）不同豇豆豆荚样品的主成分分析，（B）绿色豆荚品种和（C）紫色豆荚品种花色素苷和黄酮类化合物的差异，（D）花色素苷化合物和黄酮醇化合物的log2fold change。
表3 .绿色和紫色豇豆豆荚黄酮类化合物的目标代谢组学研究(n = 3）
4 豇豆豆荚黄酮类化合物的靶向代谢组学分析
由于UHPLC系统中配备的光学检测器的灵敏度极限，在本研究的早期阶段，可能忽略了大量低于一定量的次级代谢物。面向质谱的代谢组学可以系统地识别和定量代谢物，已成为生物研究的有力工具。为了获得更多关于豆荚色素沉着代谢变化的详细信息，采用广泛目标代谢组学方法对两个豇豆品种的未成熟豆荚进行了分析。首次在豇豆中测定化合物(支持信息，表1)。本文中次生代谢物的多样性和丰富性为鉴定与荚果着色和品质相关的新化合物提供了很好的机会。鉴定的代谢物可分为9个亚类:花色素苷、查耳酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、黄酮、黄酮醇、异黄酮和原花青素(支持信息，表1)。主成分分析(PCA)和聚类分析显示，每个豇豆品种的生物复制品都被归在一起，表明代谢组学数据的高可靠性(图3A和支持信息，图1)。
豇豆品种间积累代谢产物的差异是根据折叠变化和投影变量重要性来确定的。在紫色豇豆豆荚中，共检测到56个代谢物，包括54个向上积累的代谢物和2个向下积累的代谢物(图3B)。鉴定了12种花色素苷在紫色豇豆豆荚中显示出大量的增量(图3C和表3)。换句话说，除了极微量的翠雀花素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-半乳糖苷和矢车菊素3-O-葡萄糖苷之外，大部分花青素在绿荚中根本没有合成。在紫豇豆荚中只检测到微量的花色素(翠雀花素和矢车菊素)，表明这种代谢物由于半衰期短，容易降解(支持信息，表1)。无论如何，花色素苷积累的巨大差异可以很好地解释不同豇豆品种间不同的荚果颜色。
除花青素外，大部分黄酮类化合物为无色或淡黄色。在一定程度上，这些黄酮类化合物的含量和组成也决定了蔬菜和水果的色素沉着模式。例如，粉红色番茄果实是黄色柚皮素查尔酮积累不足的结果。在鉴定的46种黄酮醇中，根据折叠变化和VIP(图3D和表3)，12种代谢物在紫色豇豆中显示出急剧增加。剩余的黄酮醇在两种材料之间没有显示出显著差异(支持信息，表1)。简而言之，其他30种代谢物的增强生物合成分散在7个黄酮类亚类中，包括查耳酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、黄酮、异黄酮和原花青素(表3)。在紫色豇豆豆荚中，只有牡荆素(黄酮)和柚皮芸香苷(二氢黄酮)表现出被抑制的积累。从这些通过宽靶代谢组学获得的结果，可以进一步得出关于类黄酮积累的几个结论:(1)豇豆中的大多数类黄酮以糖苷形式存在，即使检测到少量的类黄酮苷元；(2)集中分布在花青素和黄酮醇亚类中的上调的黄酮类代谢产物；(3)对A-、B-、C-环的不同修饰(如糖基化、甲基化和酰化)产生了大量的结构变体，大大增加了豇豆中黄酮类化合物的数量；(4)与绿色品种相比，显著增强的花青素和黄酮类化合物共同决定了紫色豇豆豆荚的诱人颜色。
5 豇豆转录组测序概述
为了研究紫豇豆荚果中花青素和黄酮积累增强的分子机制，应用RNA-Seq进行转录组分析。在豇豆未成熟发育阶段收集两个品种的豆荚，并用于构建G1、G2、G3、P1、P2和P3的6个测序文库，具有3个生物学重复。六个样本的转录组测序产生了总共24.3 Gb的原始数据，其中90.64%为干净的Q30(表4)。在所有干净的读数中，92.92%至94.22%与豇豆参考基因组唯一匹配。绿色品种共检测到23 915个表达基因，紫色品种共检测到24 211个表达基因。在新基因挖掘分析的基础上，共有1434个基因对豇豆具有特异性，其中658个在非冗余数据库中进行了功能注释(支持信息，表2)。尽管如此，这些新基因可能真的存在于豇豆基因组中，尽管它们没有被预测算法检测到。聚类分析表明，所有的生物复制都聚集在一起，表明本研究的RNA-Seq数据的高可靠性(支持信息，图2)。
图4.豇豆豆荚中DEGs的GO功能分类。
6 GO和KEGG途径分析
根据log2 |Fold Change|> 1和FDR < 0.05的标准，在G与P的比较中有4142个GEG。比较两个品种，2180个基因上调，1961个基因下调。GO分析将2655、355和1131个单基因分别分配给生物过程、细胞成分和分子功能类别(图4)。在生物过程类中，大量基因被注释为参与类黄酮生物合成和类黄酮代谢过程，正如所预期的那样。然而，也有一些基因被注释为参与非生物胁迫和激素过程。在“细胞成分”类别中，相当多的DEG与叶绿体发育和光合作用有关。在“分子功能”类别中，最常用的术语是“转录调节区DNA结合”和“四吡咯结合”。总之，大多数DEG主要与类黄酮合成和代谢、叶绿素合成和光合作用以及非生物胁迫反应有关。
为了进一步了解豇豆豆荚的颜色，DEGs随后被比对到KEGG数据库。在前20个富集途径中，比对到代谢途径的DEGs所占比例最大，“次生代谢物的生物合成”和“植物-病原体相互作用”位居第二和第三。具体而言，紫色豇豆豆荚中明显富含参与花青素和类黄酮积累的类黄酮生物合成和类苯丙酸生物合成途径(图5)。此外，大量编码ABC转运蛋白的基因也明显富集，表明合成的花青素和黄酮类化合物需要转移到合适的细胞器中储存。然而，请注意，参与光合作用的天线蛋白在所有途径中显示出最高的富集因子(图5)。结合GO分析和KEGG途径分析的结果，很容易看出大量类黄酮生物合成和类苯丙酸生物合成的途径基因在G和P的比较中表现出显著的上调。
图5.豇豆KEGG途径富集的散点图。
7 豇豆豆荚类黄酮积累的转录组和代谢组联合分析
如图6所示，除了C4H (Vigun08g135200)、FS (Vigun08g092000)、LAR (Vigun07g195600)和ANR (Vigun03g118800和Vigun03g118700)的稳定基因表达之外，紫色缸豆豆荚中的基因表达上调强烈地增强了类黄酮的生物合成。显然，紫色豇豆豆荚中次级代谢物的调节是由花青素和类黄酮生物合成途径的结构基因的大量上调所主导的(图6)。在紫色豇豆荚果中，与绿色品种相比，结构基因表现出大倍数变化和高RPKM值的上调，增加了花青素和类黄酮生物合成途径中的通量。值得注意的是，除C4H外，苯丙素生物合成主干途径中所有结构基因的强激活表达最终导致各种花色素苷的显著产生。由于F3′H(vigun 10g 163500)、F3′5′H(vigun 06g 23200)、FAOMT (Vigun03g168200)、3MaT1 (Vigun05g032800、Vigun05g033100、Vigun05g220700)和UFGT (Vigun05g205900)的催化活性增强，各种花色素素具有不同的修饰(如羟基化、甲基化、糖基化和脱乙酰化)。然而，在花色素苷途径中的一些重要中间体(如无色花色素和花色素苷)既没有增加也没有发现明显的信号，表明这些代谢物可能在豇豆豆荚中不稳定。
在类黄酮生物合成途径中，查尔酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、黄酮、黄酮醇、异黄酮和原花青素的产量也大规模增加(图6)。例如，主干途径基因和FLS (Vigun08g161200和Vigun09g269400)的上调导致黄酮醇苷元和中间产物二氢黄酮醇的增强生产。此外，活化的UFGT催化黄酮醇苷元的糖基化，导致不同黄酮醇衍生物的生物合成增加。值得一提的是，F3′H对二氢黄酮醇和黄酮等多种底物在C3′能催化B环羟基化。在植物中，F3’H也能催化芹菜素向木犀草素的转化。在很大程度上，它可以解释紫豇豆荚中木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素7-βO-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′，7-二O-葡萄糖苷和其他黄酮苷积累的改善(表3和图6)。类似地，LAR不仅催化无色矢车菊素转化为儿茶素，还催化无色天竺葵素转化为阿夫泽瑞金。随着IFS (Vigun03g175400、Vigun03g175800和Vigun03g175900)的上调，阿福豆素和相关异黄酮糖苷的产量增加也很容易理解。尽管两个豇豆品种的LAR和ANR表达没有明显差异，但广泛增强的类黄酮途径确实为黄烷醇生物合成提供了更多的前体。因此，原花色素单体的缩聚可能被进一步促进(表3和图6)。
DRF (Vigun08g013800)在类黄酮途径中是最显著上调DEG的，增加了5000倍，其次是CHS (Vigun01g080800)和ANS (Vigun02g171400)，其在紫色豇豆荚果中显示48.5倍和29.8倍的上调(图6)。这些结果表明结构基因的大量转录物是豇豆荚果中大量花青素和类黄酮积累的重要前提。特别是，显著上调的进入点酶CHS无疑将增强通过类黄酮途径的碳通量，导致紫色豇豆中类黄酮的整体产量增加。类似地，催化花青素生物合成主干途径第一步分支的FLS的高表达，为紫色豇豆中黄酮醇的大量积累提供了很好的解释。在植物中，次生代谢物，如类黄酮，通常被转化为它们的糖缀合物，然后在液泡中储存。这些糖基化反应主要由糖基转移酶催化。UDP-糖基/黄酮糖基转移酶(UFGTs)是一种糖基转移酶，通常表现出广泛的底物，如花色苷、黄酮和羟基香豆素。从逻辑上讲，有限数量的表达上调和高FPKM值的真核细胞可以催化许多黄酮苷元的糖基化是合理的(图6)。
图6.不同豇豆品种未成熟豆荚中花青素和类黄酮途径基因的转录谱。红色实心圆圈代表代谢物的log2fold change(G对P)。(G)绿色豇豆品种；(P)紫色豇豆品种。从浅紫色到深紫色的网格代表log2FPKM-55(G对P)。
8 豇豆荚果转录因子分析
为了研究紫色豇豆花青素和类黄酮生物合成基因显著上调的调控机制，进一步分析了转录因子编码基因的转录本。总共鉴定了430个差异表达的转录因子编码基因(表5和支持信息，表4)。前25个上调差异表达的转录因子被分为不同的家族，如MYB、bHLH、WRKY、AP2/ERF、GRAS、bZIP、C2C2、C2H2、GNAT和MADS盒(表5和图7A)。令人惊讶的是，前五个上调差异表达的转录因子都属于MYB家族，这表明MYB转录因子在花青素和类黄酮积累的调节中具有极其重要的作用。与绿色豆荚相比，19个上调和4个下调的MYB转录因子在紫色豇豆中被鉴定为显著的DEGs(表5和图7B)。对这些MYB蛋白的序列分析表明，五种转录因子与花青素和类黄酮调节密切相关(图8)。三个R2R3MYB基因(Vigun05g039700、Vigun05g039300和Vigun05g039800)与必需花青素调节基因AtPAP2/AtMYB90具有高度的序列同源性，被命名为VuMYB90-1、VuMYB90-2和VuMYB90-3。同样，另外两个MYB基因(Vigun11g115400和Vigun01g142900)与AtCPC和AtMYB4具有高度的序列同源性，分别命名为VuCPC和VuMYB4(图8)。对来自不同物种的MYB蛋白的多重比对分析显示，VuMYB90-1 (Vigun05g039700)、VuMYB90-2 (Vigun05g039300)、VuMYB903 (Vigun05g039800)和VuMYB4 (Vigun01g142900)与其它花青素和类黄酮调节因子共享相同的保守R2和R3基序(图8A)。然而，VuMYB4缺乏一个保守的[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序，该基序与靶基因的转录激活密切相关。51 VuMYB90-1、VuMYB90-2和VuMYB90-3与glyma.09g235100、AmROSEA1、AmROSEA2、AmVENOSA、MdMYB10、BoPAP2和AtPAP1聚集在一起，调节不同植物物种各种组织中所有花青素的生物合成。一方面，早些时候，单基因(Vigun05g039500)被证明是豇豆种子花青素积累的候选基因。
另一方面，VuMYB4与类黄酮MYB阻遏物紧密聚集，如FaMYB1和AtMYB4。此外，VuCPC (Vigun11g115400)与花青素MYB阻遏物(AtCPC和SlTRY)紧密聚集，只有一个R3结构域。巧合的是，这五个编码MYB转录因子的基因正是紫色豇豆荚果中表达最高倍数上调的基因(图7)。综上所述，这些结果强烈表明VuMYB90-1、VuMYB90-2、VuMYB90-3、VuCPC和VuMYB4参与豇豆荚果花色苷和类黄酮的转录调控。
表5 .绿色和紫色豇豆品种豆荚 (Gb vs Pc)中差异表达的转录因子a。（注：a差异表达基因通过FDR ≤ 0.05和log2ratio绝对值≥ 1进行鉴定,Gb绿色豇豆品种,Pc紫色豇豆品种）
图7.绿色和紫色豆荚间差异表达的转录因子编码基因(G vs P)。(A)紫色品种未成熟豆荚中编码上调程度最高的基因的前25个转录因子。(B)两个豇豆品种幼荚间所有差异表达的MYB基因。(G)绿色豇豆品种；(P)紫色豇豆品种。
图8.豇豆等物种MYB转录因子推导氨基酸序列的系统发育和多重比对分析。（A）来自选定物种的MYB转录因子的多重比对。R2域和R3域分别用粗线和虚线加下划线。一个C端保守的[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序被框在红框中。（B）豇豆R2R3MYB蛋白的系统发育分析以及在其他物种中鉴定的MYB科的功能性类黄酮调节剂。
图9.解释豇豆荚果色素沉着内在机制的工作模型。
9 豇豆荚果花青素和类黄酮积累的转录调控模型
广泛的研究表明，由R2R3-MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40重复蛋白组成的三元MYB-bHLH- WD40蛋白复合物(MBW复合物)在花色素苷和类黄酮途径中调节结构基因的中心作用，尽管每个蛋白家族的特定成员在不同物种中可能不同。在拟南芥中，花青素的积累直接由R2R3-MYB蛋白(PAP1/ MYB75、PAP2/MYB90、MYB113和MYB114)、bHLH蛋白(GL3/bHLH001、EGL3/bHLH002和TT8/ bHLH042)和WD40蛋白TTG1的组合作用转录激活。GL3和EGL3还通过与其他MYB调节因子相互作用参与毛状体和根毛的调节，而TTG1参与所有这些MYB-bHLH相互作用，主要是为了稳定MBW复合体。其他花青素阻遏物包括负控制色素沉着的R3-MYB蛋白MYBL2和CPC和特异性抑制C4H转录的R2R3-MYB蛋白MYB4，也已被鉴定。ANL2是一种同源结构域蛋白，是营养组织中花青素生物合成所必需的。原花青素的生物合成主要由六种转录因子控制，包括TT1(一种锌指蛋白)、TT2(一种R2R3-MYB蛋白)、TT8、TT16(一种MADS盒蛋白)、TTG1和TTG2(一种WRKY转录因子)。在幼苗发育过程中，三种R2R3-MYB蛋白，即MYB11、MYB12和MYB111，由于它们的空间分布，以相加的方式调节根和子叶中黄酮醇的积累。
在这项研究中，与绿色品种(图7和图8)相比，在紫色豇豆的豆荚中发现三个R2R3MYB调节因子编码基因与ATPasp 2/MYB 90和单基因(glyma.09g235100)显示出高度同源性。此外，这三个基因的表达谱与花青素和类黄酮途径中的大多数结构基因高度一致(图6和图7)。这些发现强烈表明，这三个R2R3MYB基因的高倍数上调是豇豆紫荚表型的原因。对FPKM值的进一步分析表明，AtTT8、AtGL3、Atgl 3和AtTTG1的所有同源基因在两个豇豆品种之间表现出稳定的表达。然而，已经证明，对于许多豆科植物来说，AtTT8的直向同源物是类黄酮积累的必要调节物，这表明MYB-bHLH相互作用是豇豆花色素苷调节的重要前提。此外，WD40家族的一些调节因子在植物细胞中总是显示组成型表达。因此，提出了一个解释豇豆豆荚中花色苷和类黄酮积累的工作模型(图9)。
实际上，VuMYB90-1、VuMYB90-2、VuMYB90-3、VuCPC、VuMYB4和内源性bHLH和WD40蛋白通过结构基因的转录调节协调调节花青素和类黄酮的积累。随后，上调的结构基因增加了花青素和类黄酮途径的流量，导致紫色豇豆豆荚的着色(图9B)。相反，由MYB花色素苷调节子的缺乏导致的MBW复合物装配缺陷未能激活决定性结构基因的转录。显然，主要的主干途径基因只显示出微量的表达，不能产生明显的花青素。因此，瓶颈效应导致花青素生物合成的不足最终导致绿色荚果(图9A)。
在这个模型中，花青素结构基因被紫色豇豆中R2R3MYB蛋白(VuMYB90-1、VuMYB90-2和VuMYB90-3)、bHLH蛋白和WD40蛋白的组合作用转录激活。由于花色素苷与黄酮类化合物的其他亚类共享部分生物合成途径，因此有理由推测，增强的花色素苷可能促进黄酮类化合物的其他分支途径中的通量，从而产生更多的前体或中间体。尽管黄酮类化合物的大量积累在植物中提供了各种保护功能，但这些次生代谢物的产生确实消耗了大量的初级代谢物和能量，进一步导致混乱或对其他生物过程产生抑制作用。通常，类黄酮在幼叶中积累，通过吸收高能量子来保护叶绿体免受光抑制和光氧化损伤。从幼苗期到成熟期，叶片中叶绿素含量增加，黄酮类化合物逐渐降解。然而，紫豇豆荚果中光合作用活性降低与类黄酮生物合成之间的关系尚不清楚。为了平衡紫豇豆豆荚中类黄酮代谢和其他生物过程之间的平衡，VuCPC可能通过与bHLH蛋白竞争结合而作为阻止类黄酮过量产生的制动因子，导致功能性MBW复合物的装配混乱。对于黄酮类化合物生物合成途径中唯一稳定表达的基因VuC4H，VuMYB4可能抵消了VuC4H启动子上的转录激活MBW复合物。此外，两个豇豆品种之间其他转录因子的显著表达差异表明，豆荚色素沉着的分子机制可能比我们最初提出的更复杂。然而，整合的转录组学和代谢组学研究提供了对紫色豇豆豆荚中花青素和类黄酮积累的系统理解。总之，三种时空特异性表达的R2R3-MYB蛋白，即VuMYB90-1、VuMYB90-2和VuMYB90-3，在内源bHLH和WD40蛋白的帮助下，以累加方式触发豇豆豆荚中花青素和类黄酮的积累。此外，未知信号诱导的转录阻遏物(VuCPC和VuMYB4)可能通过负反馈机制抑制花青素和类黄酮的产生，导致紫色豇豆豆荚中类黄酮和其他代谢物之间的代谢平衡，这些工作为今后豇豆种质资源的研究和利用奠定了良好的基础。
1 科研│J AGR FOOD CHEM（一区）：代谢物和转录组综合分析了红皮龙眼果皮着色机理（国人佳作）
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