编译：永稷，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
植物根际保护性微生物的富集抑制了病害的发生。然而，根际保护性微生物的紊乱对病害抑制作用的影响仍未可知。
本研究对韩国三个不同地点的温室中健康和发病番茄植株地下30 cm的根际微生物群落进行分析。结果表明，发病根际土（DRS）中革兰氏阳性菌放线菌门和厚壁菌门的丰度低于健康根际土（HRS）中的丰度，而两种表型的土壤中青枯病的丰度没有显著变化。通过500 μg/mL万古霉素对健康根际土（HRS）中的革兰氏阳性菌进行人工扰动，发现番茄青枯病的发病率上升。
为了对健康根际土特异性植物保护作用的革兰氏阳性菌进行鉴定，通过分离培养获得326株热稳定性细菌。其中，Brevibacterium frigoritoleransHRS1（耐寒短杆菌）、Bacillus niacini HRS2（烟酸芽胞杆菌）、Solibacillus silvestris HRS3（银色固体杆菌）和Bacillus luciferensis HRS4（虫荧光素杆菌）对青枯病菌无直接的抑制活性，但是可以诱导植物免疫。由这4株菌所构成的合成菌群较单个菌株能够显著诱导寄主免疫来抵御青枯病的发生。
总体而言，本研究首次证明病害根际土中保护性革兰氏阳性菌失调会促进病害的发生。
原名：Disruption of Firmicutes and Actinobacteria abundance in tomato rhizosphere causes the incidence of bacterial wilt disease译名：番茄根际厚壁菌门和放线菌门微生物的失调导致了青枯病的发生通讯作者单位：韩国科技大学生物工程学院生物系统与工程系及韩国侵染病害研究中心分子植物细菌实验室
1 温室中番茄青枯病枯萎症状的不均一分布
本研究对韩国三个不同地点温室的青枯病症状的发生进行观察。然而，这些症状在三个理化性质不同的地点的发生是随机的，并不会在整个温室中进行传播（图1a）。在空间距离小于30 cm的两个健康植株之间会有若干青枯病所导致的番茄植株的枯萎死亡（图1a）。健康根际土和发病根际土中青枯病劳尔氏菌的含量分别为9.3×105和1.1×106，但两者之间的差异不显著（图1b）。接种102-3的青枯病劳尔氏菌就会导致细菌性枯萎病的发生。因此，根际中病原菌数量的变化并不能表明健康和发病植株之间青枯病发生的差异。由于根际微生物群落的组成常常被用于测定番茄对青枯病的抑制作用，本研究对健康根际土和发病根际土样本中微生物对青枯病的发生的响应程度进行测定（图1a）。用2.5 mM的MES缓冲液处理植株后（阴性对照），青枯病症状在接种11天后呈现。用0.5 mM苯丙噻二唑（BTH）处理后的植株（药剂对照）会激活植物的免疫反应来抵御青枯病劳尔氏菌的侵染，接种11天后发病率减少75%，13天后发病率减少58%，12和14天无明显作用。健康根际土会显著降低青枯病的发病率，在11、13和14天对青枯病发病率的降低程度达到83%、65%和64%，12天时无作用。此外，发病根际土在所有时间点均不会对番茄青枯病的发生产生抑制作用。这些数据表明两个番茄植株青枯病发生程度的不同是由于土壤微生物组的组成不同所导致的，而并不是有由病原菌的丰度所决定的。
图1 两株相邻番茄植株根际抑病程度的差异。（a）田间发病现象及样品处理示意图。（b）田间土样中青枯病菌的丰度。（c）病情指数分级。（d）健康根际土和发病根际土的盆栽防效评价。为了对健康和发病根际样本微生物组成差异进行检测，对7个健康根际土和8个发病根际土进行16SrRNA扩增子测序（图2）。相对丰度分析表明：变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、酸杆菌门和拟杆菌门是门水平上主要的细菌群落（图2a）。α多样性表明细菌均一度和丰度之间没有显著差异，而基于Bary-Curtis距离的主坐标分析PCoA表明健康土和发病土样本之间存在显著差异（图2b）。在5个主要的门中，革兰氏阳性菌厚壁菌门和放线菌门的数量在发病根际土中的含量较健康根际土中的含量更高（图2c）。健康根际土中厚壁菌门的数量在三个地点分别增加了1.57倍、1.13倍和1.25倍（图2c）。健康根际土中放线菌门的数量在三个地点分别增加了1.15、1.12和1.23倍（图2c）。此外，两个地点的变形菌门和拟杆菌门在健康土中的数量低于发病根际土，而另一个地点刚好相反。酸杆菌门刚好相反。为了健康根际土中厚壁菌门和放线菌门的丰度差异进行验证，本研究采用3%KOH测验和选择性培养基培养的方法进行菌落数量的统计。在两个实验中，健康根际土壤样本中厚壁菌门和放线菌门的比例分别增加了26.2%和26.3%，较发病根际土壤样本而言。为了对健康根际土中厚壁菌门和放线菌门差异最为显著的扩增子序列，本研究运用Lefse方法从健康根际土壤和发病根际土壤之间相对丰度显著不同的扩增子序列突变体中挑选了前三的厚壁菌门和放线菌门（图2e）。在厚壁菌门扩增子序列突变体中，5个杆菌纲和1个梭菌纲的扩增子序列突变体是健康根际土壤中显著富集的差异序列（图2e）。与此同时，在放线菌门扩增子序列突变体中，5个放线菌纲和1个酸杆菌纲在健康根际土壤中显著富集的差异序列。这些数据表明根际芽孢杆菌纲和放线菌纲相对丰度的改变决定了番茄植株对青枯病的抑制作用。
图2 基于扩增子测序的健康根际土和发病根际土微生物群落差异（a）三个试验田两种土样微生物组成。（b）基于Bray-Curtis距离的β多样性主坐标分析（PCoA）。（c）三个试验点革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌丰度测定。（d）两种方法测定健康根际土和发病根际土革兰氏阳性菌相对丰度。（e）三个实验田健康根际土和发病根际土中厚壁菌门和放线菌门差异分布。3 在健康根际土壤中厚壁菌门和放线菌门失调对病害抑制作用的影响为了对厚壁菌门和放线菌门在番茄抵御青枯病发生中的作用进行测定，本研究运用万古霉素对健康根际土壤中厚壁菌门和放线菌门的生长进行特异性的抑制（图3a）。基于优化实验结果（表1），将提前用500μg/mL万古霉素处理或不处理的健康根际土和发病根际土添加到番茄根系中（图3b）。与健康根际土处理相比，万古霉素提前处理的健康根际土显著的增加了青枯病的发病程度，在接种12、13、14、15和16天后发病程度分别增加了1.8、1.7、1.5、1.5和1.5倍（图3b）。相对应地，万古霉素前处理的发病根际土与发病根际土处理相比，不会改变青枯病的严重程度（图3b）。与对照相比，外源万古霉素处理不会降低青枯病的发病程度（图3b）。不同浓度的万古霉素对青枯病劳尔氏菌不具有直接的抑制作用。通过3%KOH实验和选择性培养基实验发现，万古霉素处理后的健康根际土中厚壁菌门和放线菌门的比例较健康根际土处理后根际的占比下降了25.5%和36.1%，而万古霉素处理发病根际土和不处理发病根际土的处理中无显著变化（图3d）。所有处理中青枯病劳尔氏菌的丰度没有显著差异。这些数据表明，万古霉素对健康根际土特异性厚壁菌门和放线菌门的扰动减弱了健康根际土壤所介导的对青枯病劳尔氏菌的抑制作用。
图3 番茄根际放线菌门和厚壁菌门的失调。（a）万古霉素人为扰动试验流程图。（b）万古霉素人为扰动发病程度。（c）万古霉素对青枯病病原菌的扰动。（d）万古霉素对革兰氏阳性菌的扰动4 在健康根际土样本中所富集的厚壁菌门和放线菌门的分离在所分离的326株菌株中，健康根际土和发病根际土中属于厚壁菌门和放线菌门的微生物分别为59株和67株（图4a）。从三个不同健康根际土样本中，分离得到30个特异性芽孢杆菌目和1个放线菌目的细菌（图4a，b）。从Damyang健康根际土中分离得到一个放线菌（弗氏短杆菌Brevibacterium frigoritolerans）和12个芽孢杆菌（图4b）。从Yongin健康根际土中分离得到1个放线菌和9个芽孢杆菌。从Gwangju健康根际土中分离得到1个放线菌和10个芽孢杆菌。其中耐寒短杆菌B. frigoritolerans HRS1 (HRS1)、烟酸芽胞杆菌B.niaciniHRS2 (HRS2)、银色固体杆菌S.silvestris HRS3 (HRS3)和虫荧光素杆菌Bacillus luciferensis HRS4是健康根际土中关键的微生物种类，培养后的丰度均>5%。HRS1在三个地点均能分离得到，HRS2可从Damyang和Yongin区域分离得到，HRS3和HRS4可分别从Yongin和Damyang位点分离得到。这4株菌均对500μg/mL的万古霉素敏感。健康根际土中耐寒短杆菌B. frigoritolerans HRS1 (HRS1)和烟酸芽胞杆菌B.niacin HRS2 (HRS2)的丰度较发病根际土丰度的5.5和5.22倍（图4c）。而银色固体杆菌S.silvestris HRS3 (HRS3)和虫荧光素杆菌Bacillus luciferensis HRS4在健康根际土中的丰度虽然高于发病根际土，但差异不显著（图4c）。与对照相比，接种13天和14天后，菌株HRS1和HRS2显著降低了病害发病程度（图4d）。与对照相比，苯并噻二唑仅仅在接种13天后降低了病害的严重程度，而HRS3和HRS4在所有位点均不能对青枯病产生抑制作用（图4d）。这些结果表明耐寒短杆菌B. frigoritolerans HRS1(HRS1)和烟酸芽胞杆菌B. niacin HRS2 (HRS2)在番茄对青枯病的抑制作用中具有重要的抑制作用。接种0周后 HRS1、HRS2、HRS3和HRS4群落丰度为1.8 × 10 7 , 1.6 × 10 7 , 2.4 × 107 , and 1.7 × 10 6；接种1周后，群落丰度为3.5× 10 6、5.2 × 10 4、7.6 × 10 4 和1.3 × 10 5；接种2周后群落丰度为6.1× 10 5、3.1 × 10 2、7.3 × 10 3和3.6 × 10 3（图4e）。然而，这些菌株在表面消毒的根系和茎部为检测到。
图4 健康根际土和发病根际土中热稳定性厚壁菌门和放线菌门的分离鉴定。（a）菌株分离流程图。（b）分离菌株鉴定及其在三个来源地的分布。（c）差异微生物的丰度。（d）差异微生物的抑病效果评价。（e）差异微生物的定殖。由于青枯病菌和单个菌株共培养过程中无拮抗活性（图5a），故假设4株根际微生物可通过激活番茄植株的诱导系统性抗性来对青枯病劳尔氏菌产生抑制作用。当4株分离菌株接种到番茄根际后，青枯菌劳尔氏菌接种到番茄茎部，使得病原菌和生防菌保持一定的空间距离（图5 a,b）。在对照试验中，茎部接种病原菌较根部接种病原菌发病早9天（图5c，d）。BTH在接种两天后显著的降低了病害的严重程度，达到1.5倍（图5c）。HRS1和HRS2接种3天病害严重程度降低了1.4和1.6倍，且是BTH的1.5倍多（图5c）。然而，HRS3和HRS4对病害不具有抑制作用。这些数据表明HRS1和HRS2会激发番茄的诱导系统性抗性来抵御青枯病劳尔氏菌。除此之外，健康根际土处理对番茄诱导系统性抗性的诱导，在接种后3天时菌株HRS1和HRS2的2倍之多，并且会维持到接种后第5天（图5d）。与对照相比，接种2,3,5天后，健康根际土能显著降低病害严重程度，降低了2.4、2.5和1.4倍（图5d）。这些结果进一步证明了健康根际土中的厚壁菌门和放线菌门激发了植物的诱导性系统性抗性这一假设。
图5 放线菌门和厚壁菌门的单个菌株激活番茄诱导系统性抗性对青枯病的抵御。（a）皿内拮抗作用评价。（b）不同部位接种试验。（c）单个菌株接种试验。（d）土壤微生物总体接种试验。7 厚壁菌门和放线菌门最简合成菌群对诱导系统性抗性的激活当单个接种菌体时，接种4天后HRS1和HRS2均不能降低青枯病劳尔氏菌的严重程度（图5c）。然而，与对照相比，HRS1和HRS2混合接种4天和5天后，显著降低了病害严重程度，降低了1.7和1.5倍，与健康根际土接种处理对病害的抑制程度相似。因此，通过不断添加HRS3和HRS4产生最简合成菌群，并对其抑病程度进行评价（图6a）。尽管与对照相比，HRS1+HRS2+HRS3组成的最简复合菌群在接种4天和5天后对病害严重程度的降低为1.5倍，但与HRS1+HRS2构成的复合菌群对病害的抑制程度无显著差异（图6a）。此外，与对照相比，由HRS1+HRS2+HRS4构成的复合菌群在接种后4、5、6天对病害的严重程度的降低为1.5、2.0和1.3倍（图6a）。与对照相比，由4株菌所构成的极简复合菌群接种4、5、6、7天后对病害的严重程度降低了2.0、1.8、1.3和1.2倍。这些数据表明由4株菌所组成的复合菌群能够激发番茄植株更高水平的诱导系统性抗性来抵御青枯病劳尔氏菌。为了更进一步验证由4株菌所组成的合成菌群能否激发番茄植株的防御响应，本研究分别在接种0 h和12 h后对防御相关信号基因（JA/SA/ET/ABA）的表达量进行测定（图6b）。合成菌群处理后茉莉酸信号标志基因Pin2、AOS和LoxD的表达量上调了3.9、1.8、1.9倍，而苯并噻二唑不会激发这些基因的表达量（图6b）。此外，与对照相比，合成菌群使得水杨酸信号标记基因PR-P6、NPR1和PR1a上调表达了3.5、1.7和2.0倍，而苯并噻二唑（BTH）对水杨酸信号基因的上调表达量分别为6.1、1.5和7.9倍（图6b）。然而，乙烯ET和脱落酸ABA信号基因不会被合成菌群或者苯并噻二唑所激活。这些数据表明合成菌群会优先激活番茄植株茉莉酸和水杨酸信号相关的诱导系统性抗性来抵御青枯病菌。
图6 合成菌群SyCom对诱导系统性抗性的激活。（a）合成菌群SyCom构建及防效评价。（b）合成菌群SyCom诱抗作用评价。
综上所述，本研究揭示了常见的保护性微生物（链霉菌、芽孢杆菌）所属门级水平（放线菌门和厚壁菌门）的微生物在植物病害防御中具有重要的作用。田间不同试验地根际土微生物群落组成及丰度测定发现放线菌门和厚壁菌门在番茄抵御青枯病中具有重要的作用。通过将田间根际土转移到温室盆栽体系中进行放线菌门和厚壁菌门的人为扰动，更进一步证明放线菌门和厚壁菌门微生物的作用。通过对差异微生物进行分离培养和鉴定，皿内拮抗和盆栽防效表明差异微生物防控番茄青枯病的机制是激活植物诱导系统性抗性。将差异微生物构建合成菌群，发现合成菌群较单个菌株对青枯病的防效更好，对植物诱导系统性抗性相关基因的上调表达更显著。最终阐明保护性微生物厚壁菌门和放线菌门通过诱导植物免疫反应而在在植物病害防控中发挥作用。
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