综述(下) | Nature 子刊：肠道微生物群和NAFLD—代谢紊乱中的微生物标志物
编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道菌群在宿主消化、免疫和新陈代谢中具有关键的生理作用。最初仅通过基于培养的方法进行研究，随着高通量测序技术（shot弹枪测序或焦磷酸测序）的快速发展，肠道菌群的表征已加深。在肥胖症和2型糖尿病（NAFLD）中反复观察到肠道菌群失调。动物研究表明，肠道菌群在NAFLD中具有潜在的因果作用。人体研究已开始描述NAFLD中的微生物群改变，并发现了一些一致的微生物组特征，将健康个体与NAFLD，非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化患者区分开。然而，患有NAFLD的患者经常表现为肥胖或胰岛素抵抗以及2型糖尿病，并且这些代谢紊乱的代谢混杂因素经常被考虑。具有不同NAFLD严重程度阶段的患者通常表现出异质性病变和可变的人口统计学特征（包括年龄，性别和种族），这些特征会影响肠道微生物组，并且在大多数研究中都被忽视。最后，在研究中使用了多种肠道微生物组测序工具和NAFLD诊断方法，这些方法可以解释不同的微生物组特征。
本综述为人类NAFLD的微生物组特征提供了广泛的见解，并探讨了将这些特征与潜在的代谢紊乱区分开的问题-需要使用系统生物学方法进行更高级的宏基因组学和多组学研究，以改善微生物组生物标志物。
论文ID
原名：Gut microbiota and human NAFLD: disentangling microbial signatures from metabolic disorders.
译名：肠道微生物群和NAFLD:代谢紊乱中的微生物标志物
期刊：Nature Reviews Gastroenterology &Hepatology
IF：23.57
发表时间：2020年3月09日
通讯作者：Karine Clément
通讯作者单位：法国巴黎索邦大学营养组学研究组＆国立中央人民大学皮蒂-萨尔普特瑞埃医院营养部
主要内容
7 NAFLD宏基因组学研究中的问题
有关与NAFLD或NASH或纤维化相关的肠道菌群特征的临床研究数目正在迅速增加。但是，由于研究中使用的异类队列，性别，种族，肝病严重程度阶段，BMI，T2DM的存在，患者人群，肥胖症和其他相关代谢的差异，在回顾进展时需要详细阐述。在研究中使用的肠道菌群测序技术因研究而异，影响肠道菌群的其他关键因素很少测量或报告不足。
7.1 人口统计学特征的变异性
尽管关于微生物组特征存在一致性，但在独立队列中明显缺乏复制结果或证实。这种异质性可能源于不同的方法论方法，也可能源于新患者之间关于特定人口统计学特征的主要个体差异。虽然一项研究仅检查了女性，但大多数研究都检查了成年男女和儿童。然而，一些研究控制了性行为，大多数研究也控制了年龄。尽管如此，要注意的是，青少年和成人NAFLD有组织学特异性。此外，在儿童中发现了几种组织学类型：类似于成人形式的1型，2型NASH的主要特征是NASH，但没有或仅有很少的球囊变性，最后是具有重叠特征的第三种。在不同的地理区域，亚洲和欧洲也进行了研究，可能具有不同的种族背景以及文化和饮食习惯。重要的是，即使居住在同一地理区域的个人，种族似乎也强烈影响微生物的组成。例如，在所有居住在荷兰的不同种族中，肠道微生物的多样性差异很大，种族是造成这些差异的主要原因。因此，尽管不同种族之间存在不同的肝病风险，但它可能会转化为与微生物组相关的差异性特征。值得注意的是，一些研究控制了饮食习惯，这可能部分与文化差异有关。
7.2 肥胖的人群变异性
肥胖，尤其是腹部肥胖是NAFLD的众所周知的危险因素，这使得这些疾病具有高度的相互依赖性。在已发表的报告中，尽管一些研究包括瘦人，但另一些研究则检查了超重或肥胖的人。几项研究甚至进一步根据肥胖症的严重程度进行了分层，其中一项研究特别关注严重或病态肥胖，并且已经证明，随着肥胖严重程度的增加，肠道菌群失调会加剧。
元基因组学研究清楚地表明了肥胖与肠道微生物组变化之间的关系。例如，随着BMI的增加，微生物基因的丰富度会大大降低。此外，尽管肥胖个体通常具有共同的细菌特征和改变的功能特性，但在整个肥胖谱中某些特征不同，只有在极端BMI的人群中才能发现独特的特征。根据这些发现，在比较具有不同肥胖程度的NASH患者和以NAFLD为瘦或超重的NASH患者作为对照或以肥胖和NASH的不同类别的患者以及以健康瘦人为对照的研究中，微生物组相关的特征可能被高估，且多数与肥胖程度有关。与肥胖和NAFLD等密切相关的代谢紊乱之间的联系可能比仅细菌组成的变化更为复杂。因此，仍然难以断定这些特征是否仅与肝脏改变，BMI或两者有关。
在肥胖者和肥胖患者以及NAFLD和一些NAFLD瘦的个体中，都发现微生物基因丰富度降低。更重要的是，BMI是肥胖的代名词，未来的研究应将表型扩展到与体脂量和分布有关的其他指标，以检查脂肪分布，肝脏改变的不同阶段和微生物组改变之间的相互作用。确实，微生物基因丰富度与内脏脂肪沉积的增加呈负相关。
7.3 代谢疾病和相关治疗中的人群变异性
另一个主要的混杂因素是肥胖相关的代谢合并症，也与NAFLD生理病理学有关。糖尿病是NAFLD发展的主要危险因素，其存在严重加剧了NAFLD成为明显的NASH，包括与轻度和晚期纤维化相关的形式。已知代谢综合征或T2DM与微生物特征有关。因此，将微生物特征与NAFLD和相关的代谢性疾病区分开来可能很困难。从流行病学证据推断，患者可能同时患有NAFLD和T2DM。梭菌和乳酸杆菌是在T2DM和NAFLD中发现的两个常见物种特征。在预测的功能水平上，患有T2DM的患者和患有NAFLD的患者均显示出产生丁酸盐的细菌持续减少。大肠杆菌在研究肝硬化或仅糖尿病的研究中不断丰富。相比之下，蔷薇属在研究中表现出相反的趋势。但是，有研究仅在其NAFLD队列中纳入了6名患有T2DM的患者，这解释部分不一致的结果。重要的是，一些寻找NAFLD微生物特征的研究控制了他们对T2DM的存在分析，以限制这种偏倚。例如，在对T2DM进行适当调整后，微生物特征仍与NAFLD相关，但并非在所有研究中均重复结果。在包括非T2DM患者在内的研究中，只有一个患者的胰岛素抵抗得以控制。
药物的使用是影响个体之间微生物组签名差异的另一个关键特征。NAFLD微生物组特征的研究包括T2DM患者，而其他人则将其排除在外，但大多数并未明确说明研究参与者正在服用的药物清单。只有三项评估NAFLD期间微生物特征的研究控制了药物的使用。二甲双胍是T2DM处方药物治疗的第一线，通常在NAFLD中使用，因为根据人口和种族，有50-75％的NAFLD患者患有T2DM。二甲双胍可增加鼠疫阿克曼氏菌的含量，该细菌与小鼠和人类的胰岛素敏感性提高相关。此外，用二甲双胍对HFD的小鼠进行治疗可概括胰岛素敏感性的改善，并使微生物群组成朝着日粮饮食的小鼠转变。服用二甲双胍的T2DM患者表现出特定的微生物组特征，其中大肠埃希菌种类增加，这可以部分解释在NAFLD纤维化患者中发现的大肠杆菌增加。
7.4 肝损伤诊断方法的变异性
另一个可变性来源是不同等级和阶段以及肝脏疾病改变的异质性。使用SAF评分似乎可以改善观察者间的差异性，NAFLD诊断中也可以确认检查活检样本时个体间病理学家之间的差异。由于肝脏病变紧密缠结在一起，因此对每种组织学病变的特定微生物特征进行解密是具有挑战性的。研究集中在疾病进展的不同阶段。由于大多数研究并不关注疾病进展的相同阶段，因此强调一致的微生物特征是相当具有挑战性的。
用于检查NAFLD病变的诊断方法也是检查这些研究时要考虑的重要因素。肝活检是最可靠的诊断方法，目前被认为是已用于九项研究的金标准。但是，其他人则使用了可靠性较低且非侵入性的工具，例如超声检查，MRI或血液检查以及其他新陈代谢-相关的生物标志物或肝脏相关的生物标志物。这些非侵入性工具旨在专门表征一个组织学方面，这些患者可能表现出未经检查的异质性病变。此外，病变严重程度不同。除了在可能的情况下优先使用肝活检外，在进行文献比较时，还应考虑使用诊断工具和其评估结果来评估肝脏改变。
7.5 由于昼夜节律的偏见
在检查肠道菌群和NAFLD的文献中另一个被忽视的因素是昼夜节律的贡献。昼夜节律是肝脏代谢途径的众所周知的关键调节剂，其在NAFLD发育中发生改变。动物研究和实验模型表明，进食时间也会影响昼夜节律，进而影响宿主的生理机能。在不同的小鼠模型中进行的研究都显示，肠道菌群在白天的增殖过程中表现出结肠的节律性振荡，并取决于宿主生物钟的功能。这些振荡是由宿主摄食量控制的。有趣的是，修改进食时间会导致循环细菌的转移。此外，定时喂食可以恢复昼夜节律缺乏小鼠的波动损失。在实验模型和人类中，昼夜节律的扰动也与代谢损伤和微生物群失调有关。相反，肠道微生物群及其昼夜节律的振荡也会影响宿主肠和肝脏基因的节律性表达，这些基因尚不清楚是否与昼夜节律有关。此外，在肠道微生物群不存在的情况下，这些基因的表达模式会被修改，因为来自多个代谢途径的基因会失去其振荡模式，而在动物模型中，来自其他代谢途径的基因会因缺乏微生物群而获得节律性。因此，经历了明暗循环的无菌小鼠显示出昼夜节律性肝基因表达受损，表明肠道菌群在昼夜节律效应中的作用。肠道菌群的变化可能会影响导致NAFLD生理病理的几种宿主代谢途径的节律性。这方面可能是由于微生物群的功能而不是组成，因为饮食中肠道微生物群产生的代谢产物还可以调节肝基因表达，这是在用不同的SCFA处理肝类器官时观察到的。此外，在时钟基因敲除模型中，调节进食时间可以挽救废除的宿主基因表达振荡，突出了昼夜节律和饮食对肠道菌群和宿主生理的综合贡献。在小鼠模型中获得的这些结果是否与人类相关还需要进一步研究。
7.6 测序方法
以前的研究使用了多种测序方法，包括定量PCR80、16S核糖体RNA（rRNA）测序或shot弹枪测序。先前已经证明，基于Sanger，Roche或Illumina的16S rRNA或shot弹枪测序可以导致不同的结果。16S rRNA测序的结果比完整shot弹枪测序的结果粒度和准确性更低，这是因为16S方法对细菌基因组的单个区域进行测序，而shot弹枪对完整的基因组进行测序。gun弹枪测序可以产生有关阅读序列的扩展信息，因为它可以对完整的基因组进行测序和扩增。因此，shot弹枪测序产生更多信息，因为它还包括未知的宏基因组物种，这有可能导致发现潜力的增加。
除了测序技术外，用于分析测序数据的生物信息也有助于解释结果的可变性。由于建立了标准管线，因此16S rRNA测序中的分类学分析更加容易，而16S rRNA的功能分析主要是通过PICRUST进行的。但是，直到现在，很少有研究能够准确地描述可用作肝病状态指标的微生物种类，甚至更少的微生物为发现新物种提供了线索。尽管微生物群目录目前非常详尽，但是测序方法和测序深度的可变性可能会影响研究结果。整个元基因组测序的使用可以提供此信息，但需要管道协调和专门的生物信息学专业知识。
7.7 多组学方法。
作为肠道宏基因组学的补充，其他“组学”数据和系统生物学方法是进一步确认特定疾病的微生物特征的好方法。通过同时使用宏基因组学和代谢组学或脂质组学，可以鉴定肠道微生物组的组成和功能特征，并将其与血液，尿液或粪便中肠道衍生代谢产物的浓度或产生联系起来。另一种方法也可以是结合宏基因组学和元转录组学数据，使特异性激活的肠道菌群基因更加清晰，并提供进一步的功能见解。这种方法已经被用于其他代谢性疾病，并在NAFLD领域中崭露头角。结合多组学技术和计算机科学的方法的使用，将可能有助于更好地了解微生物群在这些代谢性疾病涉及的病理生理途径中的贡献，并有助于根据其多组学概况对患者进行分层。
结论
临床研究表明，肠道菌群在NAFLD，NAFLD纤维化和肝硬化中具有标志性作用，可作为肝病诊断或进化预后的未来非侵入性诊断生物标志物。尽管如此，在纵向研究中医师还可以前瞻性地检查肝脏状况的恶化，因此需要进一步研究已鉴定特征的相关性。已针对克罗恩病和心血管领域的肠道微生物群因素进行了此研究，但在NAFLD的所有研究中均观察到差异，这可能是由于微生物组测序方法，生物信息学方法，肝脏诊断方法和疾病严重程度谱以及临床和人口统计学特征方面的巨大异质性。肥胖和T2DM与强烈的微生物群营养不良有关，并且确定的肝脏疾病微生物组特征通常因肥胖或糖尿病状态的额外存在而备受歧视，而肥胖或糖尿病状态并非总是如此。因此，迫切需要通过强大的研究设计进行更多的研究。研究应考虑到代谢紊乱的混杂因素，例如T2DM和肥胖，人群背景以及药物和饮食摄入。一种选择还可以是另外检查在2型糖尿病或肥胖患者中经过精心选择和临床协调的队列中已鉴定的特征。但是，考虑到一些潜在的混淆因素，例如昼夜节律，可能对研究人员和患者而言都是一项复杂的任务。未来的研究还应考虑分两步研究肠道微生物组特征。通过使用具有不同且已记录的种族背景的发现和验证队列，包括具有活检证实的NAFLD或NASH诊断的患者。在可能的情况下，也应考虑进行第二次纵向研究并结合肝脏活检进行反复探索，以确认临床进展。总体而言，最佳研究设计是否可行仍然是一个悬而未决的问题，无论如何都应在大型研究财团的背景下加以考虑。最后，该领域需要用于预测微生物组特征的高级方法。优先研究整个微生物生态系统，其中微生物的相互作用与单个或多个家族，属或物种的丰富性一样重要。同样，值得研究的是改变微生物组因素的重要性，例如噬菌体或病毒和真菌。将微生物组特征与系统性微生物衍生代谢产物结合起来，可以在将来帮助常规诊治肝病患者。可靠的生物标记物的潜在建立将决定未来的NAFLD-NASH治疗如何调节这些标记以开发生物标记物，从而对治疗反应进行记录。
评论
本综述为人类NAFLD的微生物组特征提供了广泛的见解，并探讨了将这些特征与潜在的代谢紊乱区分开的问题-需要使用系统生物学方法进行更高级的宏基因组学和多组学研究，以改善微生物组生物标志物。对肠道微生物组与相关疾病关系的探讨具有深远意义。
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