科研 | Gastroenterology: 从婴儿期到幼儿期微生物群的发展以及与出生方式、饮食和特应性疾病的关系
编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。
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婴儿期胃肠道微生物群的建立影响免疫系统发育和口服耐受诱导。这一时期微生物群的扰动可能导致免疫介导性疾病的发生。该研究通过各种多变量的纵向模型(包括联合模型)的应用，对5周到6-11岁儿童粪便微生物的多样性、组成和群落结构的动态变化以及随后发生特应性皮炎和哮喘的风险进行了研究。该研究结果表明，在过敏症状出现之前，微生物多样性和组成就已经发生了变化，同时也强调了可能的混杂因素的重要性。
论文ID
原名：Development of the Microbiota and Associations With Birth Mode, Diet, and Atopic Disorders in a Longitudinal Analysis of Stool Samples, Collected From Infancy Through Early Childhood
译名：在从婴儿期到幼儿期收集的粪便样本的纵向分析中，微生物群的发展以及与出生方式、饮食和特应性疾病的关系
期刊：Gastroenterology
IF：20.773
发表时间：2020.1
通讯作者：Gianluca Galazzo
作者单位：荷兰马斯特里赫特大学医学中心
实验设计
结果
1 研究人口的特征
本研究最初设计为一项通过口服热灭活大肠杆菌和粪肠球菌裂解液预防特异反应性皮炎（AD）的随机、安慰剂对照试验，包括具有单一或双重遗传的健康新生儿(n = 606)。在生命的前3年，通过体检和收集7次临床访问的详细问卷，儿童被深深地表型化。学龄儿童时期再次回访，确定是否存在哮喘和过敏性致敏。
在本研究中，只有第一年收集了至少3个粪便样本和/或学龄期收集了粪便样本的儿童(n = 440)被纳入研究。在这些孩子中，217名(49.3%)是女孩，187名(42.5%)有哥哥姐姐，109名(24.8%)是剖腹产，29名(6.6%)在出生后31周内接受了抗生素治疗。除6名儿童外，所有儿童均接受母乳喂养，尽管母乳喂养时间差异很大，中位时间为40周。固体食物的引入年龄中位数为25周。
2 早期婴儿和学龄期儿童微生物群的发育
作者首先检测了婴儿期微生物群的组成变化，并将其与学龄期的微生物群组成进行了比较。分别在产后5周(306)、13周(287)、21周(268)和31周(307)以及学龄期(300)收集样本，通过扩增子测序分析了16SrRNA高变V3基因区域。
在对测序深度较低的样本(n = 15)进行质量筛选和去除后，1,453个样本的中位测序深度为62,420 reads/样本(范围为15,540-168,848)，将其保留下来进行下游分析并聚类为873个操作分类单元(OTUs)。根据香农指数评估，微生物多样性在5-13周龄之间没有显著差异，但从出生后13周至21-31周后逐渐增加(图1A)。学龄时香农指数的急剧增加显示微生物多样性增加最大的是在31周后。主坐标分析表明，未加权Unifrac评估的微生物群落结构在婴儿期也逐渐发生变化，最显著的变化发生在21-31周(图1B)。然而，与婴儿样本相比，学龄儿童样本单独聚类，个体间差异较小。
在婴儿期发现的放线菌门、拟杆菌门和变形杆菌门中的大多数OTUs在出生后5周就已经存在，而在厚壁菌门中几乎一半的OTUs只在婴儿后期获得。在学龄期，许多新的放线菌、厚壁菌门和拟杆菌门在婴儿期已经存在的OTUs出现。相比之下，在学龄期变形杆菌门中只出现了很少的新OTUs，而在学龄期以后，新生OTUs的很大一部分就消失了。
接下来，作者研究了对微生物多样性和群落结构的时间动态贡献最大的细菌属。到学龄期，变形杆菌门内许多属的数量明显下降，而厚壁菌门内属的数量明显上升，特别是在长柄菌科和瘤胃球菌科(图1C)。此外，除双歧杆菌外，所有主要细菌属的相对丰度在婴儿期和儿童期均有显著变化。5周龄以大肠杆菌属最多，其次是双歧杆菌和链球菌。在31周龄时，大肠杆菌仍然是最丰富的属，但现在排在其后的是拟杆菌属和细孔菌属。学龄期最多的属为白菌属、粪小杆菌属和瘤胃球菌属。
图1 微生物群在婴儿期和儿童期成熟(440名儿童的粪便样本，N= 1,453)
3 母乳喂养时间的长短是影响婴儿微生物群组成的主要因素
为了确定与婴儿期微生物群动态相关的协变量，作者继续对婴儿样本进行分析。基于PTU水平数据的狄利克雷多项式(Dirichlet omial, DMM)模型形成了六个簇(图2A-B)。为了说明样本在每个DMM集群中随年龄的变化，作者使用了前面描述的转换模型。cluster 1和cluster 3在5周龄时最具优势，此后过渡是混乱的，这与先前确定的生命最初14个月的微生物组发育阶段相一致。尽管在31周龄之前，cluster 1仍占主导地位，但cluster 3逐渐消失，取而代之的是cluster4和cluster 5(图2C)。多项logistic回归分析表明，5周龄时的初始菌群主要由出生方式决定的。剖腹产婴儿中，新生儿菌群属于cluster 3的几率明显增加。这个簇在几个驱动OTU的丰度方面有显著的不同。特别是Klebsiella OTU表现出较高的丰度，而Escherichia OTU则占据了其他许多集群。另外，cluster3有柠檬酸杆菌、Leclercia和Raoultella OTUs (图2B)。对最常见的过渡轨迹进行分析后发现，无论是从cluster 1开始的儿童还是从cluster 3开始的儿童，在停止母乳喂养后，向cluster 4和cluster 5过渡的显著增加。这些结果进一步支持了整个婴儿期的整体细菌概况。5周龄时，差异最大的是出生方式(图3A)。在属水平上，与剖宫产相比，阴道分娩在5周和31周时与类杆菌的富集最为相关。在13、21和31周时，母乳喂养与目前为止最大的细菌群落变化显著相关(图3B-D)。经多元变异分析证实，母乳喂养时间的影响大于固体食物的影响(图3E)。在停止母乳喂养后，双歧杆菌、葡萄球菌和链球菌等显著减少，而Lachnospiraceae科的许多细菌增多。
母乳喂养时间越长，微生物多样性越低,microbial-by-agez-score(MAZ)也低。在已知生物年龄的数据集上，通过一个机器学习算法来计算MAZ，然后根据样本的微生物群组成来预测样本的年龄。因此，较低的MAZ表明微生物成熟较晚。此外，在31周龄时，与哥哥姐姐的接触与放线菌门中几个属的增加和微生物多样性的增加有关。最后，除了饮食因素外，微生物群落结构与样品采集时AD的存在密切相关。
图2 用狄利克雷多项混合模型将婴儿样本分为六个群集
图3 母乳喂养对微生物群落结构的影响最大
4 特异反应性的表现是由微生物组成、多样性和成熟度的变化引起的
接下来，作者检查了婴儿的微生物群组成是否也与学龄期的过敏症状有关，包括过敏性敏化和哮喘。在本研究的440名儿童中，292名学龄儿童的血液样本可用来测定过敏敏感性。作者发现婴儿微生物群的多样性越高，在学龄期过敏反应的风险就越低。生命早期较高的微生物成熟度与过敏反应的风险增加有关，这与AD的发现一致。然而，在相当长的一段时间内，作者不能鉴别出个别的细菌种类，它们的丰度在有或没有发生过敏反应的儿童之间存在差异。
讨论
与经阴道分娩的婴儿相比，剖宫产婴儿的微生物群落结构的差异和较低的拟杆菌类物质丰度一直持续到31周龄，并经受住了包括母乳喂养在内的其他决定因素的相互调整。这说明母乳喂养并不能弥补剖宫产的影响。考虑到在剖宫产出生的儿童中，未来疾病(包括过敏和哮喘)的风险增加，有必要进行更多的研究来阐明在剖宫产后恢复自然微生物定植过程的必要性和有效性。
该研究进一步表明，停止母乳喂养与微生物组成和成熟度的关系比固体食物的引入更为密切。这些结果表明，只要继续母乳喂养，固体食物的引入似乎不会导致微生物群落结构的深入变化。只有当母乳喂养停止后，随着人乳寡糖降解物的减少和微生物多样性的增加，以及专门降解复合膳食碳水化合物的细菌属的成分变化，微生物群的成熟才会加速。婴儿在母乳喂养期间普遍观察到的微生物多样性较低，这乍一看似乎与健康和有弹性的微生物群落高度多样化的概念相矛盾。然而，与大多数前瞻性研究一致，作者没有发现母乳喂养时间与AD风险之间的直接联系。母乳喂养降低了包括代谢性疾病在内的其他几种疾病的风险，而代谢性疾病也与较低的微生物多样性有关，这一事实表明，在考虑微生物多样性时，环境是至关重要的。例如，微生物群多样性的丧失通常为机会性入侵者打开了缝隙，而母乳喂养转移的过多的生物活性成分可以防止这种机会性病原体的定植。这进一步强调了对饮食进行细致调整的必要性，因为饮食是微生物群与疾病结局之间关系的混杂因素。
通过多变量的纵向分析，研究进一步证明了微生物群落结构、多样性和成熟度以及几个属的相对丰度与过敏症状的后续发展有关。从以往的动物研究和大量的纵向人类研究中得知，过敏性疾病中的肠道微生物失调主要发生在生命早期的一个关键时期。然而，研究之间的可比性受到早期时间窗口内高度动态的微生物群落的限制，这可能导致在不同的采样时间点出现不同的关联。本研究的主要优势在于前瞻性设计、重复样本收集和深入的临床表型分析。
通过前3年的定期体检，结合收集详细的问卷数据，不仅可以进行深入的临床表型分析，而且可以准确地评估发病时间。对学龄期的随访进一步促进了对发展为过敏性哮喘的儿童的可靠分类，因为众所周知，早期的喘息症状通常是短暂的，是由偶发性病毒感染引起的。作者观察到较低的微生物多样性与AD的发生和过敏反应有关，但与哮喘无关。这与先前的研究一致，也报道了与AD和致敏相关的微生物多样性减少。相比之下，微生物多样性与气喘或哮喘之间的联系往往不能被观察到。虽然特应性表现是常见的共病，但这些结果支持了COPSAC先前的结论，即不同特应性疾病之间的风险因素外推可能并不总是合理的。
几种类型的纵向数据分析的应用，包括纵向和生存数据的联合建模，这些数据以前没有用于微生物群数据分析，使研究能够证明在特应性疾病的临床表现之前微生物多样性、成熟度和组成的变化。虽然这个统计框架揭示了关联的时间性，从而提出了因果关系，但因果关系永远无法在观察性研究中得到证实。例如，微生物干扰可能是暴露于另一个未知的过敏危险因素的附带现象。此外，不能排除过敏的早期临床前表现或过敏的遗传倾向可能影响微生物群的组成。此外，在收集粪便方面的发现可能不能完全反映微生物组在(小)肠粘膜过敏发展水平上的变化。
综上所述，该研究结果证明了出生方式和饮食对婴儿菌群早熟的重要性，并证明了在仔细调整重要的混杂因素后，婴儿肠道微生物定植过程的改变先于AD、致敏和哮喘的发生。特别是Lachnospiraceae科的成员，以及Faecalibacterium和Dialister属的成员似乎可以防止过敏。这些发现进一步支持了未来针对微生物群的循证干预策略的发展，以预防或治疗早期过敏性疾病。
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