科研 | JBC：转录组揭示了肝脏禁食与进食周期中基因表达的调控具有小鼠品系特异性
编译：知予，编辑：十九、江舜尧。
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肝脏通过激素调节和神经调节相结合进行营养状态的调节，并维持代谢稳态。许多研究者利用小鼠研究肝脏对营养物质的刺激做出的调节反应。然而不同品系的小鼠对于营养物质敏感性的差异是否影响肝脏禁食与进食周期中基因表达的调控，尚属未知，也是本文研究的重点。研究人员基于小鼠肝脏的RNA测序发现进食能够引起两种品系小鼠（C57BL/6J和BALB/cj小鼠）肝脏基因表达的明显而短时的变化。大多数发生变化的转录本来源于生物调节，细胞代谢过程。三大营养物质代谢过程中，摄食对脂质代谢的影响最大。另外，C57BL/6J和BALB/cj小鼠的基因表达存在明显差异。在禁食和复饲过程中，有10200个基因在两种品系小鼠的肝脏中具有相同的表达变化，另有400-600个基因仅在其中一种品系中出现差异调控。在共同表达的约10200基因中，相对于C57BL/6J小鼠，进食诱导了BALB/cj小鼠肝脏中更多脂肪生成相关基因的表达。而在表达差异的400-600基因中，C57BL/6J 小鼠表达的参与脂质代谢的基因比B ALB/cJ小鼠更多。总之，该研究表明，两种品系小鼠在肝脏禁食与进食周期中基因表达调控具有明显差异，尤其体现在脂肪代谢相关基因中。为日后肝脏营养物质代谢研究实验动物的选择提供依据。
论文ID
原名：Regulation of gene expression during the fasting-feeding cycle of the liver displays mouse strain specificity
译名：肝脏禁食与进食周期中基因表达的调控具有小鼠品系特异性
期刊：Journal of Biological Chemistry
IF：4.106
发表时间：2020.02
通讯作者：Jeffrey E. Pessin
通讯作者单位：Albert Einstein College of Medicine
DOI号：https://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.RA119.012349
实验设计
研究者选取8周大C57BL/6J和BALB/cj两种品系的小鼠，按照表1将其分为8组，每组设置5个重复，共40个样本。经过进食和低脂喂养适应后，于晚7点开始禁食，次日晚7点算作禁食对照组，处死取肝脏组织。其余组复饲，分别于10点（进食3h）,1点（进食6h）,7点（进食12h）处死取材。取出的肝脏组织立即于液氮中速冻保存，后使用Trizol等试剂统一进行RNA提取。提取出的RNA经过浓度检测，琼脂糖凝胶电泳及Agilent2100完整性和污染程度检测，质检合格后，由Novogene进行全基因组mRNA测序以及基因文库构建。简单来说，使用poly-T oligo附着磁珠从总RNA中纯化mRNA并进行碎裂。反转录为cDNA后，长度为150bp,成对且被两端读取的cDNA片段被收集进行文库构建。使用DESeq2 R进行各组基因表达的差异分析，每百万映射读取（FPKM） 计算以规范读取计数，基于每个样本的每个基因的FPKM，计算Pearson系数的平方（R2s），以显示样本与重复之间的相关性。将组内FPKM计算平均值，使用log10(FPKM+1)值绘制基因表达映射的热图。Gene Ontology (GO)系统分析组间差异表达基因，进行注释和分类。Ingenuity Pathway Analysis (IPA)绘制基因共表达网络图。以上方法共同评估了不同品系小鼠肝脏在进食和禁食周期中基因调控的差异。另外分析研究者使用实时荧光定量的方法，选取小鼠肝脏中表达的15个具有代表性的基因进行验证。
结果
1 数据有效性检测
本研究所有样本的RNA-seq数据已存入GEO数据库，供公众查阅。图1A显示了这些数据的重复性和可靠性。第1组的重复样本间的基因表达具有很好的相关性。第1组所有样品与其他其余 7组样品之间的R2均大于0.92。样本的相关系数矩阵显示各组数据均具有良好的相关性（图1B）。这些数据表明mRNA测序结果的有效性。
2 全基因组基因表达与聚类分析
为了探究不同组间基因表达结果差异的规律，研究者对所有分组基因表达进行了分层聚类分析。计算每组基因的平均FPKM，将所有基因的log10（FPKM1）投射在热图中（图2A）。热图显示了两组不同品系小鼠的明显差异。在不同的进食时间点，同品系小鼠的基因表达相似，而不同品系小鼠间的基因表达差别很大。图2B与组间欧几里得距离的计算也证实了这一点（图2B）。
对C57BL/6和BALB/cj小鼠差异表达基因进行量化分析（四个时间点绘制-log10（PADJ）与log2二维点图）（图2C-2F），发现不同的进食时间点，两组品系小鼠的肝脏基因表达均表现出明显差异，在禁食状态下，约有12%的基因显著差异表达。进食后，差异表达基因增加，于进食6小时达差异基因数峰值，在12小时的时间点下降到接近禁食状态的水平。差异表达基因的最大数目出现在进食6小时这一时间点。
3 从禁食到不同进食时间点基因表达差异的变化
为了研究进食过程中，营养物质对于肝脏基因表达的影响，研究者绘制了各进食时间组与禁食对照组差异基因表达数量统计图（图3A-3F）。总的来说，表达水平发生显著变化的基因数，随进食时间先增后减。在C57BL/6J小鼠中，随着时间的推移，进食改变的基因数量逐渐增加，并在进食后约6小时达到峰值水平，随后开始恢复到禁食水平。在BALB/cj小鼠中，因进食而改变的基因的数量在进食后3小时左右更快地达到峰值水平。这一水平保持到进食后6小时，随后下降，并在餐后12小时恢复到禁食水平。并且，研究者发现，在进食过程中，相比于C57BL/6J小鼠，BALB/cj小鼠肝脏发生表达变化的基因更多。
4 进食引起差异表达基因的聚类分析
通过上述的研究发现，在进食后6小时，肝脏基因表达变化最大，因此研究者选取这一时间点作为研究的重点。与禁食状态相比，在C57BL/6J小鼠肝脏中，有1189个基因表达显著下降，882个基因表达显著升高（PADJ≤0.05）。在下调的1189个基因中，有273个基因的下调非常显著，其表达量的下降达2倍以上。
同样，在BALB/cj小鼠肝脏中，进食后6小时，有1192个基因显著下调，1180个基因显著上调（padj≤0.05）。在这1192个显著下调的基因中，425个基因表达量减少了2倍或更多。而对于这425个基因的GO分析结果显示，18%的基因参与代谢过程，27%的基因参与细胞过程（图5A）。更细致的划分表明，参与代谢过程的基因中，有25%参与细胞代谢过程（图5B），这与C57BL/6j小鼠的分析结果十分相似。对参与细胞代谢过程的基因的进一步分类，发现17%的基因在脂质代谢中起作用，4%在氨基酸代谢中起作用（图5C）。另外，在BALB/cj小鼠肝脏显著上调的1180个基因中，444个基因表达量增多了2倍或更多，这其中21%的基因参与代谢过程，对这些基因细致划分，参与代谢过程的基因中又有34%参与细胞代谢过程（图5E），进一步分类表明，其中25%参与脂质代谢，3%参与氨基酸代谢（图5F）。总的来说，分析发现，BALB/cj小鼠脂质代谢过程中下调基因的数量与C57BL/6J小鼠相似,但上调基因数是C57BL/6J小鼠的3倍之多。相比之下，两种小鼠氨基酸代谢相关基因的表达量比较相近。
5 进食使小鼠肝脏基因共表达网络改变
为了探究显著变化的基因之间的互作关系，并对涉及的信号通路进行预测，研究者对发生显著变化的基因进行了IPA通路分析。如图所示，分别得到了两种品系小鼠肝脏脂质代谢过程的基因共表达网络（图6A，6C）。其中PPARα（Pparα）是由直接关系形成的网络中心，而Letpin（LEP）是由间接关系形成的网络中心。PPA Rα是一种转录因子，是肝脏脂质代谢的主要调节因子。它在能量剥夺的条件下被激活，在进食时，其表达又被抑制。在这两种品系的小鼠肝脏中，pnpla2（脂肪酶）、cyp4a11（单加氧酶）、socs2（细胞因子信号的抑制因子）和pck1（关键糖异生酶）表达下调。另外也有差异存在，A cot1（酰基-CoA硫酯酶）在C57BL/6J小鼠中表达下降，脂肪素编码磷脂磷酸酶Lipin，在BALB/cj小鼠中表达下调。
两种品系小鼠之间的差异主要存在于上调基因及其参与的共表达网络中，除了两种品系中都有所上调的Pparδ, Fasn 和 Acyl外，BALB/cj小鼠肝脏中的Acsl3, Cyp2c18, Scd1, Elovl5 和 Elovl6显著上调。而这些基因在脂肪酸和脂质生物合成中起着重要作用。两种品系小鼠氨基酸合成代谢过程中的基因表达情况是相似的（图6B，6D）。例如，CPT1表达下调，而ETHE1表达上调。
6 两种小鼠品系的基因表达和聚类差异
具体来讲，在禁食状态下，有479个基因仅在C57BL/6J小鼠中表达，519个基因仅在BALB/cj小鼠中表达。使用GO分析对这两组独特表达的基因进行生物过程、代谢过程和细胞代谢过程三个层次的分析，在细胞代谢过程中发现了两组间最明显的差异，在C57BL/6J小鼠中，有约32%的基因参与脂质代谢过程，而在BALB/cj小鼠中参与脂质代谢过程的基因仅占6%。在BALB/cj小鼠中发现有6%和5%的基因分别 参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢，这也是BALB/cj小鼠所独有的（图7B，7C）。
进食后6小时的分析显示，396个基因仅在C57BL/6J小鼠肝脏中表达，602个基因仅在BALB/cj小鼠中表达（图7A）。与禁食状态下的分类相似，在生物和代谢过程的两个水平上，基因表达都存在差异。最大的差异存在于细胞代谢过程中。在细胞代谢过程中，C57BL/6J 小鼠肝脏中特异表达的基因中有36%参与脂质代谢过程，而BALB/cj小鼠中仅有12%（图7D，7E）。同样，仅在BALB/cj小鼠中各有2%的基因参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢（图7D，7E）。
从前面的分析可知，在禁食和进食的状态下，两种品系的小鼠肝脏中各有一些基因高表达（图8A，8D）。研究者量化分析了两组小鼠肝脏基因表达的差异，并分别对这些基因进行了细胞代谢水平的聚类分析。在禁食状态下，C57BL/6J 小鼠肝脏中参与脂质代谢基因的百分比远高于BALB/cj小鼠（29%vs.18%）,但BALB/cj小鼠高表达基因中参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢的基因比列高于BALB/cj小鼠（图8B，8C）。同样，在进食6小时后，两组间参与脂质代谢过程基因数的差异与禁食类似。而C57BL/6J小鼠中参与氨基酸代谢的基因百分比高于BALB/cJ小鼠（3%vs.2%）,这与禁食状态相反。
讨论
营养素是机体能量供应的必要物质，同时促进大分子物质合成，调节酶活性。机体通过进食各种食物进行宏观营养素摄取，通过消化吸收等生理过程为机体提供必要的能量。而这些过程通过变构调节的信号通路和转录信号来控制基因表达。肝脏是控制营养物质代谢的主要器官，通过调节脂肪生成、脂解、糖异生、糖原分解和糖酵以维持能量平衡。为了研究禁食-进食过程中，肝脏基因表达的变化，研究者对C57BL/6J和BALB/cj小鼠肝脏进行了一项mRNA测序研究。本研究提供了可靠的测序结果，描述了两种品系小鼠肝脏在禁食和进食过程中基因表达的变化及差异。这些数据的重要性主要体现在几个方面，首先它提供一个可靠的正常肝脏生理基因表达数据集，可作为其他研究的正常对照的参考。其次发现了小鼠品系之间的生物变异性，作为了解生理和病理生理状态变化的关键因素。
进食过程导致C57BL/6J和BALB/cJ小鼠肝脏基因表达发生显著而短暂的 变化（图3）。研究表明，进食使糖异生过程相关基因被抑制，而脂肪生成相关基因被激活。然而，除这些已知途径之外，研究者发现还有许多基因也受到进食过程的调控。事实上，进食后6小时，在C57BL/6J小鼠2071个受到调控的基因转录本中，42.6%（882）的基因表达升高，57.4%（1，189）的基因表达降低。同样的，在BALB/cj小鼠中， 受到调控的2372个基因中有49.7%（1180个）的基因表达增加，50.3%（1192个）的基因表达减少。虽然这些基因参与多种生物过程，但大多数转录本都属于生物调节、细胞和代谢过程（图4，5）。在三大物质代谢过程中，进食对脂质代谢过程基因表达的影响最大。
进食过程产生的基因表达变化表现出明显的小鼠品系特异性。对于BALB/cj小鼠，在参与细胞代谢过程的基因中，进食使31%的基因表达升高，另有31%的基因被抑制。相反，在C57BL/6J小鼠中，进食抑制了细胞大分子代谢途径中9%的基因表达，诱导了32%的基因表达。在脂质代谢过程中，C57BL/6J小鼠的进食抑制了20%基因的表达，另有19%的基因表达升高（图4）。相应的，BALB/cj小鼠的进食抑制了17%基因的表达，有25%的基因表达升高（图5）。
对C57BL/6J小鼠来说，在进食引起显著改变的2071个基因中，仅有1.7%的基因在C57BL/6J这一品系小鼠中特异性表达。同样的，对于BALB/cj小鼠，进食引起表达变化的2372个基因中，有2.8%的基因在BALB/cj这一品系小鼠中特异性表达（图7A）。这些数据表明，进食引起的表达变化的基因大多在两种小鼠品系中均存在，在这其中，BALB/cj小鼠有更多的基因参与脂质代谢。
进食后6小时，C57BL/6J特异表达的396个基因中，有8.8%的基因发生表达变化。而在BALB/cj特异表达的602个基因中，10.9%的基因表达发生改变。相比于BALB/cj小鼠，C57BL/6J 小鼠特异表达的基因中有更多的基因参与脂质代谢过程（图7C）。MUPS是一类脂钙蛋白，运输小的疏水分子，包括类固醇和脂类。它们在C57BL/6J小鼠肝脏中特异表达。研究表明，MUPS与能量调节有关，它们通过直接抑制肝脏中的脂肪基因来限制葡萄糖的产生。
另外，禁食状态下，在两种小鼠品系共同表达的基因中，7%的基因在C57BL/6J小鼠肝脏中高表达，6%的基因在BALB/cj小鼠中高表达。差异表达基因共11.5%（图2G）。在进食后6小时，总差异表达基因的百分比增加了两倍。C57BL/6J和BALB/cj两种品系小鼠肝脏基因表达在进食诱导下的变化也有差异。随时间而发生的基因表达变化的数据表明，进食后，BALB/cj小鼠肝脏基因表达改变更加敏感，而恢复表达的速度更快。这也许是BALB/cj小鼠对饮食诱导的代谢/生理变化更有抵抗力的原因之一，例如高脂饮食诱导肥胖。
综上所述，本研究提供了提供了C57BL/6J和BALB/cj两种品系小鼠肝脏在禁食与进食周期中基因表达变化的可靠数据。这些数据表明，进食引起两种品系小鼠基因表达变化大致相似，但控制细胞代谢过程的基因表达存在明显差异。这些差异可能解释了这两种小鼠品系对饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗的敏感性差异。为其他基于小鼠模型开展的营养物质代谢的研究提供了更多的数据支持。
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