科研 | Nat. Protoc.：基于LC-MS开发的血浆拟靶标代谢组学方法手册（国人佳作）
编译：北越城主，编辑：Emma、江舜尧。
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非靶标方法通常用于代谢组学研究中的小分子有机化合物的检测和发现，超高效液相色谱-高分辨质谱法（UHPLC-HRMS）是非靶标代谢组学最常用的平台之一。尽管非靶标代谢组学没有偏向且具有很高的覆盖范围，但非靶标的方法达不到令人不满意的可重复性以及对复杂数据处理的要求。基于三重四极杆质谱（TQMS）的靶向代谢组学可能具有互补性，因为它具有高灵敏度，高特异性和出色的定量能力。但是，它通常适用于已知的代谢物。拟靶向代谢组学融合了非靶向代谢组学和靶向代谢组学的优点，可以作为非靶向方法的替代方法。在这里，我们描述使用UHPLC-TQMS的拟靶向代谢组学的详细实验方法。使用使用少量分析样品获得的混合物，进行了涉及多个UHPLC-HRMS的深入，非标的代谢组学实验，其中MS在不同的碰撞能量（正负两个）下运行。XCMS，CAMERA和多反应监测（MRM）用于查找和注释峰，并选择将用于分析实际样品的变化。一组内标标准品用于校正保留时间的变化。可以实现高覆盖率和高性能的定量分析。整个方案需要约5天的时间才能完成，并且可以同时对800-1,300种代谢物进行半定量分析。
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前言
1. 拟靶向代谢组学的发展
我们的研究小组于2012年首次提出了拟靶向代谢物组学的概念。在这项工作中，修改基于GC-MS的非靶向方法，方法是开发一种算法，该算法可以从所有检测到的代谢物中选择离子进行离子监测。通过这种方法，可以使用保留时间锁定GC-MS选择的离子监控器收集样品中已知和尚未鉴定的代谢物的数据。拟靶向代谢组学方法已在2013年扩展到LC-MS。但是，拟靶向代谢组学方法的构建仍然很耗时且费力，尤其是从成千上万的候选物中选择离子对进行监测的过程。为了自动，系统地定义离子对，开发了内部软件“多反应监测-离子对查找器（MRM-离子对查找器）”，这使为非靶标代谢谱分析定义MRM跃迁的过程变得更容易且更省时。
与数据依耐性采集（IDA）相比，所有理论碎片离子的连续数据采集（SWATH）提供了更高的MS2信息覆盖范围，因为从理论上讲它可以获取所有前体离子的碎片信息。一种基于MRM跃迁的方法关于SWATH MS的采集，名为“SWATH to MRM”，也已出版。我们的小组还提出了一种基于UHPLC-SWATH MS的拟靶向离子对选择方法。
已开发出针对尿液，血清和植物样品的拟靶向代谢组学方法，并将其扩展至高覆盖率伪靶向脂质组学方法。在具有不同研究目的的这些应用中，拟靶向方法已显示出非常好的性能。
2. 拟靶向方法与其他方法比较
拟靶向代谢组学被认为是第二代代谢组学方法，它融合了非靶向和靶向数据采集策略。在基于HRMS的无目标方法中，精确质量和MS2信息用于识别，通常会生成数千个特征和数百个已识别的代谢物。不幸的是，未靶向方法的定量性能不如TQMS中基于MRM的靶向方法的定量性能。拟靶向代谢组学是非靶向代谢组学的另一种方法，因为它比非靶向代谢组学具有更高的灵敏度和更宽的动态范围，并且不需要复杂的特征检测或峰比对过程。此外，来自不同分析批次的拟靶向代谢组学的数据易于校准和整合。另一方面，通过使用真实的化合物建立定量方法很方便，因为拟靶向代谢组学是在MRM模式下进行的。
对于典型的靶向代谢组学，MRM过渡依赖标准品；因此，靶向代谢组学因缺乏标准化合物而受到限制，通常价格昂贵。为了提高针对没有标准化合物的目标方法的覆盖率，报道了通常通过全扫描电子喷雾电离（ESI）MS构建的MS2光谱标签数据库。但是，MS2频谱标签数据库的构建很复杂，并且这种数据库包含大量的冗余数据。一些公共的MRM过渡存储库可用，但是不同系统或样品类型之间的兼容性通常不好。拟靶向代谢组学中使用的MRM转换来自要分析的生物样品。与上述目标方法相比，拟靶标方法具有更高的覆盖范围和更广泛的适用性。
3. 拟靶向代谢组学方法的优点
在拟靶向代谢组学中，可以实现定量分析的高覆盖率和高性能的定量分析。不需要像非靶向代谢组学那样的复杂特征检测或峰比对过程。此外，在大规模代谢组学分析中，可以轻松地校准和整合来自拟靶向代谢组学的数据，这些数据来自不同的分析批次。最重要的是，拟靶向代谢组学允许使用TQMS实现高覆盖率，同时保留了这种检测技术的原始优势，因此只有TQMS而没有HRMS的实验室才能完成用于高覆盖率代谢组学研究的常规流程。
拟靶向代谢组学中的MRM转换基于要分析的实际生物学样品；因此，可以考虑并包括更多的MRM过渡。IDA是在几种不同的碰撞能量（CE）电压下执行的，可以快速获取大量的MS2信息，从而大大减少了优化每个过渡的TQMS参数所需的时间。XCMS和CAMERA用于执行特征检测和注释，并且这些软件包适用于不同制造商的数据格式。2016年报告的MRM-Ion PairFinder软件是系统的自动化软件，可通过前体离子对准，MS2谱图提取和还原，特征产物离子选择和离子融合来获取特征MRM离子对。在此协议中，MRM-Ion PairFinder已更新为2.0版，并通过R统计脚本语言（版本3.6.1）进行了重新编程。代码已上传到GitHub（https://github.com/zhengfj1994/MRM-Ion_Pair_Finder）。新版本更有用，也适用于负离子模式。
4. 拟靶向代谢组学的局限
拟靶向代谢组学仍然有一些局限性需要解决。首先，由于MRM转换来自生物样品而非标准化合物，因此未鉴定出某些检测到的代谢物。未知代谢物的鉴定必须使用UHPLC-HRMS / MS和其他方法进行。第二，在拟靶向代谢组学中可以检测到的代谢物数量受到UHPLC，HRMS和TQMS分辨率扫描速率的限制。例如，TSQ Altis三重四极杆质谱仪（Thermo Scientific）可以同时检测约100种化合物（周期时间为1 s和10 ms驻留时间）或约200种化合物（约200种化合物，周期时间为1 s和5 ms驻留时间）。第三，拟靶向代谢组学是一种半定量方法，在绝对定量不是强制性的发现阶段最有用。拟靶向代谢组学将成为整个研究项目的一部分，该项目可能始于非靶向代谢组学，拟靶向代谢组学的发现可以方便地用于靶向代谢组学研究，以进一步验证所获得的结果。
5. 拟靶向实验设计
设计拟靶向代谢组学实验时要考虑的关键因素包括（i）用于非靶向分析的样品，（ii）选择内标（IS），（iii）使用UHPLC-HRMS收集非靶向代谢谱数据，（iv）MRM过渡从代谢谱数据中进行选择，（v）从HRMS到TQMS的MRM转换，以及（vi）伪靶向代谢组学方法的验证。
已针对不同体液和植物样品开发了拟靶向代谢组学方法，还建立了拟靶向脂质组学方法。在该协议中，我们以血浆样品为例。对于其他样品，应根据研究目标修改样品制备和IS筛选程序。
6. 非靶标代谢组学的样本处理
为了获得要分析的给定样品的全面代谢物信息，通过UHPLC-HRMS进行的非目标代谢谱数据收集需要一个包含所有代谢物的样品。通过混合等量的待分析样品而制备的质控样品包含最全面的代谢物，可用于通过UHPLC-HRMS收集代谢谱信息。
如果通过混合所有组中的样品来制备QC混合物，则仅在一个处理组中存在的一些低浓度代谢物可被稀释至检测限以下。为避免这种稀释作用，可以将每个治疗组的等分试样分别混合，并可以分别进行不同组的QC分析。在我们的常规实验中，在准备用于非目标代谢组学分析的步骤中提取离子对的样品制备中，QC样品体积的数量是真实样品分析中的三倍，以获取有关低浓度代谢物的更多信息。此方案中使用了NIST人类血浆标准参考物质（NIST SRM 1950），以便其他实验室可以重复我们的实验或直接使用我们的MRM转换方法在UHPLC-TQMS上进行MRM分析。
7. 内标的选择
在拟靶标方法中，IS用于保留时间校准和峰面积归一化。IS的选择需要满足以下条件：（i）IS的保留时间应在色谱图中均匀分布，（ii）IS不得干扰代谢物的检测，（iii）IS的类型应可以满足不同代谢物的校准需求，并且（iv）必须在每个样品中稳定地检测出IS。
同样重要的是，所使用的每种IS的浓度均会在MS检测的线性范围内产生适当的响应。通常，标准品的浓度应与样品中代谢物的浓度相似。IS还必须是样品本身不存在的化合物，例如已知代谢物的同位素标记形式（例如L-苯丙氨酸-d5）或非天然存在的化合物（例如溶血磷脂酰胆碱（LPC）19：0）。表1列出了我们使用的IS。根据研究目标，可以使用不同的标准。
表1 拟靶标代谢组学内标的选择
8. 使用UHPLC-HRMS进行非目标代谢谱数据收集
为了收集尽可能多的代谢物信息，使用UHPLC-HRMS进行了非目标代谢谱分析。可以同时测量数千种代谢产物。参数设置应遵循制造商的建议，并针对实际需求进行优化。IDA /数据依赖性采集（DDA）用于获取MS2信息。由于代谢产物的化学性质不同，应为它们选择不同的CE电压。在低CE电压下，某些代谢物不会裂解，而在高CE电压下，某些代谢物可能会过度裂解成较小的产物离子，因此无法选择合适的特征产物离子。为了获得每种代谢物的合适产物离子，在并行LC-MS运行中设置了几个不同的CE电压。选择CE电压范围，以使大多数代谢物具有良好的响应。在此协议中，我们将CE电压设置为15、30和45V。
9. 从代谢谱数据选择MRM过渡
接下来，获得包含MS2信息的代谢谱数据。此步骤的目的是为每个前体离子定义最合适的产物离子。我们在2016年开发了名为MRM-Ion PairFinder的软件，该软件是用于获取特征MRM离子对的系统化和自动化系统。在此协议中，MRM离子对查找器已升级到2.0版，并通过R统计脚本语言（版本3.6.1）进行了重新编程。这些代码已上传到GitHub（https://github.com/zhengfj1994/MRM-Ion_Pair_Finder）。
10. MRM从HRMS过渡到TQMS的转变
为了减少UHPLC-HRMS和UHPLC-TQMS的不同UHPLC系统之间不同保留时间的影响，请使用步骤18中所述的IS使用参考文献中所述的方法对保留时间进行校准。
需要优化每种代谢物的TQMS参数，因为不同仪器的HRMS和TQMS参数并不相同，尤其是当它们来自不同公司时。HRMS的参数应作为参考，也应遵循仪器制造商的建议。为方便起见，为定义每种代谢物的最佳CE电压，我们建议在接近建议的最佳CE值（HRMS的CE和±5 eV）附近进行三次进样测试。每个MRM转换的最佳CE是具有最佳MS响应的电压。
11. 拟靶向代谢组学方法的验证
MRM过渡来自真实生物样品混合物的这种拟靶向方法是可靠的，并且不限于特定的TQMS仪器。因此，研究人员可以选择自己可用的仪器进行实验。但是，在使用已建立的拟靶向方法进行代谢组学研究之前，应进行验证以优化分析条件。拟靶向代谢组学融合了非靶向方法和靶向方法。因此，要优化的分析特性与这两种方法相似，重点在于可重复性，稳定性和线性（更多细节包括在步骤（步骤21）和预期结果中）。
根据在不同LC-MS运行中分析的每种代谢物的计算变异系数（CV），评估日内和日间重复性。在大规模代谢组学中，可以通过以分析顺序分析QC样品来评估稳定性。
通过计算质控样品的2倍稀释系列中的线性来评估每种代谢物的浓度与响应之间的关系，因为在拟靶向方法中检测到的代谢物来自生物样品，因为在拟靶向方法中检测到的代谢物是来自生物样品，因此不可能获得所有代谢物的标准品。
实验操作流程
1. 设备
涡旋混合器（VWR，目录号12620-850）
移液器和吸头
离心管（1.5 ml；Eppendorf，目录号0030120086）
高速微量离心机（Hitachi，目录号CF16RN）
离心真空蒸发器（Labconco，目录号7310031）
UHPLC系统（Waters）与三重TOF 5600+质谱仪（AB Sciex）结合使用
LC（ExionLC AD）与三重四级杆 6500（AB Sciex）结合使用
LC（Nexera x2）- MS（TQ8050）系统（Shimadzu）
液相色谱系统（Vanquish）与TSQ Altis三重四极杆质谱仪（Thermo Scientific）结合
Acquity BEH C8色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters，目录号186002878）
Acquity HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm；Waters，目录号186003539）
MSConvert（http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml，由ProteoWizard提供）
R统计脚本语言（版本3.6.1）
Skyline81 19.1（https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view，用于处理MRM数据）
2. 溶剂配置 用于保留时间校准和归一化的IS解决方案
IS储备液：将每种IS制成在适当溶剂中的1 mg / ml溶液，并保存在4°C的冰箱中。
IS提取溶液：该溶液用于蛋白质沉淀和代谢产物提取。详细信息如表1所示，将49.4 ml的乙腈添加到IS的混合溶液中。
IS复溶液：该溶液用于梯度稀释以获得具有恒定浓度的IS的210倍稀释系列。浓度与IS提取液的浓度相同（表1），但使用90％（体积/体积）的H2O / CH3OH作为溶剂。
90％水/甲醇（体积/体积）
要制备90％（体积/体积）的水/甲醇溶液，请在干净的玻璃瓶中加入90 ml超纯水，然后再加入10 ml HPLC级甲醇。
表2 在阳离子模式下的梯度洗脱
3. 流动相溶液
通过将1.0 ml的甲酸添加到1,000 ml的HPLC级水中并充分混合来制备用于正离子模式的流动相A。
通过将1.0 ml甲酸添加到1,000 ml HPLC级乙腈中并充分混合来制备用于正离子模式的流动相B。
通过将6.5 mmol的NH4HCO3溶解在1,000 ml HPLC级水中，制备用于负离子模式的流动相C。
通过将6.5 mmol的NH4HCO3溶解在1000 mL的95％甲醇和水中来制备用于负离子模式的流动相D。
UHPLC所需的其他溶液根据制造商的说明进行制备。
4. 质谱条件设置
UHPLC-HRMS仪器设置非定向分析基于此协议中结合了AB Sciex Triple Q-TOF 5600+系统（AB Sciex）的Waters Acquity UHPLC系统（Waters）。其他具有IDA / DDA的HRMS仪器也适用。
对于正离子模式，在Waters Acquity BEH C8色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上进行色谱分离，对于阴离子模式，在Waters Acquity HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）上进行色谱分离。流动相A和B用于正离子模式，柱温为50 ℃。流动相C和D用于负离子模式，柱温为55 ℃。进行梯度洗脱以检测正离子和负离子模式，分别如表2和3所示。
以下参数用于三重TOF 5600+质谱仪。正离子和负离子模式的喷雾电压分别为5.5 kV和-4.5 kV。源温度为550 ℃。干燥气体，气体1和气体2分别设置为35、55和55 psi.。在完整扫描的周期中，对20个离子强度最高的代谢物离子进行了基于IDA的自动MS2分析。前体离子和产物离子的质荷比（m / z）扫描范围设置为50-1250 Da。在正离子模式下，CE电压设置为15 V，30 V和45V。在负离子模式下，CE电压设置为-15，-30和-45V。色谱柱平衡期间未采集MS数据。
5. MRM过渡的软件
表3 在负离子模式下的梯度洗脱
UHPLC-TQMS仪器设置为了证明伪靶向代谢组学方法可用于不同的TQMS系统，我们使用了三种TQMS仪器，包括Triple Quad 6500（AB Sciex），TQ8050（Shimadzu）和TSQ Altis（Thermo Scientific）。LC分离的实验条件与上述UHPLC-HRMS的实验条件相同。详细的MS参数如方框1所示。
6. 标准操作流程
设定MRM转换的血浆/血清QC样品制备-时间〜4 h（为了在不同实验室中可以进行简单和可比较的分析，我们已经描述了市售血浆NIST SRM 1950的分析程序。要制备自己的样品，请按照步骤1、2进行操作。）
1.将要分析的样品存储在-80 ℃或液氮中。当您准备分析血浆/血清样品时，请在4 ℃的冰上融化30-60分钟。
2.从每个样品中取10-25 μl，分别混合以产生不同组的QC。每个QC的体积应≤ 200 μl。（对于包含数百个样本的大规模队列代谢组学研究，如果样本数太多，则可以通过从每组中获取代表性样本来进行质量控制。在接下来的步骤中，使用200 μl QC；剩余的体积可以存储在-80 ℃以便将来使用（例如，用于鉴定和方法验证））。
3.将800 μl IS提取溶液（4 ℃）加入200 μl血浆/血清样品中以进行蛋白质沉淀66。
4.在涡旋混合器上彻底混合60 s。
5.在15,000 g和4 ℃下离心10分钟。
6.将900 μl上清液转移至离心管中。
7.在4 ℃的离心真空蒸发器中冻干上清液。
8.在60 μl的90％（vol / vol）H2O / CH3OH中重构样品，涡旋60 s，并在15,000g和4 ℃下离心10分钟。（关键：质控样品的体积是样品分析中的三倍，以检测更多的代谢物。）
9.将上清液转移到带螺纹的颈式小瓶中，该小瓶包含用于大开口小瓶的插入管。将样品瓶放入在6-8 ℃下运行的自动进样器中。
7. UHPLC-HRMS分析 每次分析时间为30或25分钟
10.用IDA模式将5 μl提取后样品注入UHPLC-HRMS。使用不同的CE电压（建议在阳离子模式下为15、30和45 V，在阴离子模式下为-15，-30和-45 V）进行六次独立分析。关键步骤CE电压的范围应大致涵盖代谢物的最佳CE电压。
11.按照制造商的说明清洁UHPLC-HRMS。
12.存储数据。
注意：被分析的样品应按照生物安全水平（BSL）2进行灭菌和处理。
8. MRM的转换 时间约5小时
13.使用MSConvert将原始UHPLC-HRMS数据转换为XCMS支持的数据类型和mgf文件。关键步骤mgf文件应保存在单独的文件夹中，并且它们的文件名应包含CE电压的值，不得带有其他编号。
14.打开R统计脚本语言（版本3.6.1），调用XCMS，然后在控制台中执行代码以进行峰值检测。
15.调用CAMERA并注释来自XCMS的功能。首先，创建一个xsAnnotate对象，然后根据保留时间对要素进行分组。最后，标注同位素和加合物。有关如何执行峰值检测和注释的信息，请参阅https://github.com/zhengfj1994/ MRM-Ion_Pair_Finder以获得更多帮助。
16.删除冗余功能。将结果输出到逗号分隔值（csv）文件。推荐的csv文件格式可以在补充表1中看到。GitHub（https://github.com/zhengfj1994/MRM-Ion_Pair_Finder）中提供了参考代码。
17.使用“ MRM_Ion_Pair_Finder”定义MRM过渡。获得定义的MRM过渡的列表（补充表2）。根据表1中给出的保留时间和m / z信息，定义了补充表2中的IS峰。关键步骤“MRM_Ion_Pair_Finder”的参数可以显着改变MRM转换的数量。应根据收集的数据质量仔细考虑每个参数设置。有关参数的信息可以在https://github.com/zhengfj1994/ MRM-Ion_Pair_Finder找到。
9. UHPLC-TQMS的保留时间校准和CE电压优化 时间〜10 h
18.保留时间校准。在UHPLC-TQMS系统中注入〜5–10 μl IS溶液，以获得在表2（正离子模式）或表3（负离子模式）给出的色谱分离梯度下每种IS的保留时间。使用方框2和图1中所述的方法执行保留时间校准。HPLC-HRMS中IS的保留时间是从步骤16中获得的。我们已经提供了R统计脚本语言的现成函数来进行保留时间校准，并且它也已上传到GitHub（https://github.com/zhengfj1994/MRM-Ion_Pair_Finder）。关键步骤在保留时间窗口中检测到每个MRM过渡。应校准保留时间漂移，以避免假阴性。
19.CE电压优化。根据UHPLC-HRMS分析，已提出优化的CE。对于血浆/血清样品分析，如果TQMS和HRMS来自同一制造商，则可以直接使用HRMS的CE值，因为所使用的碰撞池相似。否则，在建议的最佳CE值（HRMS的CE和±5 eV）附近进行三次进样，以选择对UHPLC-TQMS分析具有较好响应的CE值。
20.删除未检测到的MRM过渡，以确保其余MRM过渡具有更长的停留时间，以实现最佳检测灵敏度。
Box2 保留时间校正公式
图1 保留时间方法校正原理示意图
10. 评估拟靶向代谢组学方法的定量性能 时间〜3 d
21.验证已建立的拟靶向方法的分析特性，包括线性，可重复性和稳定性。使用表2（正离子模式）或表3（负离子模式）中给出的色谱分离梯度和方框1中显示的TQMS的详细MS参数检测步骤20中确认的MRM转换。拟靶向代谢组学，选择选项A。要评估可重复性，选择选项B。如果要评估稳定性，请执行选项C中的步骤。
11. 在大规模代谢组学研究中的应用 时间安排取决于所分析样品的数量
22.血浆/血清样品制备。按照步骤1–8中所述准备样品。
23.基于UHPLC-TQMS的伪靶向代谢组学分析。使用表2（正离子模式）或表3（负离子模式）中给出的色谱分离梯度和方框1中显示了TQMS的详细MS参数。每批开始时，运行10个QC样品进行仪器平衡。每5-15次进样插入一个QC，用于信号漂移校准。
24.存储数据。
25.使用仪器生产商提供的软件（来自AB Sciex的MultiQuant，来自Thermo Fisher的TraceFinder和来自Shimadzu的LabSolutions）或免费软件（Skyline）提取峰面积。
26.在通过内标对峰面积进行标准化之后，除去每个样品组中＜80％的样品中可检测到的代谢物，以及质控样品中CV值> 30％的代谢物。
27.预处理的拟靶向代谢组学峰表可用于进行统计分析，包括多元分析（主成分分析（PCA），偏最小二乘判别分析（PLS-DA））和单变量分析（P值和错误发现率（FDR）。
表4 排除出现的问题
12. 预期结果
图2显示了此手册中描述的拟靶向代谢组学方法开发的概述。“MRM_Ion_Pair_Finder”可以根据MS / MS数据自动定义MRM转换，并将代码上传到GitHub（https://github.com/zhengfj1994/MRM-Ion_Pair_Finder）。该网站上也提供了峰检测，峰注释和保留时间校准的代码。
在该方案中，通过NIST SRM 1950通过三重TOF 5600+（AB Sciex）系统进行的非靶向代谢谱分析分别从正离子和负离子模式获得了1,490和984个MRM转换。补充表3和4列出了有关这些代谢物的信息。对于血浆/血清拟靶向代谢组学MRM分析，可以跳过步骤1-17，直接使用这些MRM转换。
为了验证HRMS的MRM转换适用于不同的TQMS系统，分别使用Triple Quad 6500（AB Sciex），TQ 8050（Shimadzu）和TSQ Altis（Thermo Scientific）进行MRM转换的验证。由三个质谱仪验证的MRM跃迁高度一致（图3）。TSQ Altis（Thermo Scientific）进一步用于评估伪靶向代谢组学方法的定量性能。在NIST SRM 1950中分别以正离子和负离子模式检测到880和552种代谢物。用TSQ Altis评价了伪靶向代谢组学的线性，可重复性和稳定性。为了评估MRM转换的线性，在NIST SRM 1950的整个210倍稀释系列中，计算了正离子模式下的874代谢物和负离子模式下的552代谢物的R2值。具有R2值的代谢物的百分比在正离子和负离子模式下，> 0.95分别为85％和62％（图4a）。
通过计算同一天和不同天重复注射的CV来评估可重复性。在正离子模式下，在1天10次进样后，占总峰面积的98.8％的代谢物有88.3％（737）的相对标准偏差（RSD）<15％（图4b）。在连续三天重复注射后，占总峰面积的97.2％的代谢产物中有76.6％（642）的RSD值<15％（图4c）。这些结果表明，所建立的伪靶向方法是稳定的，可用于大规模代谢组学分析。
图2 拟靶标代谢组学方法概述
图3 由不同TQMS验证MRM转换（a）正离子，（b）阴离子
图4 拟靶向代谢组学方法的定量性能
总结
拟靶向代谢组学技术作为第二代代谢组学发展的方向，结合高分辨质谱分辨率高定性好和三种四级杆质谱扫描速度快定量准确两者的特性。解决了代谢组学在做大规模定量代谢组学时对照品昂贵，建立标准库耗资巨大，定性难等诸多难题，同时又能兼顾非靶标代谢组学高覆盖率的优点。