科研| 南京大学：C60富勒醇增强Cu的毒性并改变黄瓜的叶片代谢产物和蛋白质谱（国人佳作）
编译：王艳林，编辑：Emma、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
非生物和生物胁迫诱导产生活性氧（ROS），从而限制了作物的产量。然而对于外源ROS清除剂减少ROS知之甚少。本研究中，在进行Cu胁迫之前，对三周龄的黄瓜植株叶面施用了自由基清除剂C60富勒醇（1或2 mg/植物）。结果表明，C60富勒醇通过增加Cu离子向细胞内的流入量来增加Cu毒性（对于1和2 mg的C60富勒醇/植物，分别为170％和511％）。我们进一步使用代谢组学和蛋白质组学来研究植物对C60富勒醇响应的机制。代谢组学研究表明，C60富勒醇上调了抗氧化剂代谢物，包括3-羟基黄酮，1,2,4-苯三酚和反肉桂酸甲酯等，同时下调了细胞膜代谢物（亚麻酸和棕榈油酸）。蛋白质组学分析表明，C60富勒醇上调了参与水光解（PSII蛋白），光捕获（CAB），ATP产生（ATP合酶），色素固定（Mg-PPIX）和电子传递（Cyt b6f）的叶绿体蛋白。叶绿素荧光检测表明，C60富勒醇显著提高了叶片中的电子传递速率（1和2 mg C60富勒醇/植物分别为13.3％和9.4％）。代谢途径网络的整体视野表明，C60富勒醇可加速电子传递速率，从而导致叶绿体类囊体中的ROS过量产生。植物激活的抗氧化剂和防御途径可以保护细胞免受ROS的损害。揭示的益处（增强电子传递）和风险（改变膜组成）表明，在农业应用中应谨慎使用C60富勒醇。
论文ID
原名：C60 Fullerols Enhance Copper Toxicity and Alter the Leaf Metabolite and Protein Profile in Cucumber
译名：C60富勒醇增强Cu的毒性并改变黄瓜的叶片代谢产物和蛋白质谱
期刊：Environmental Science & Technology
IF：7.864
发表时间：2019.01
通讯作者：赵丽娟
通讯作者单位：南京大学
实验设计
实验结果
1. C60富勒醇的合成与表征
制备的C60富勒醇的结构如图1A所示。如图1B所示，FTIR光谱在1106、1500和3421 cm-1处显示宽峰，这分别归因于C–O，C═C和O–H键的振动；这表明富勒烯已成功被OH基团表面修饰。TEM图像显示C60富勒醇形成均质的核壳纳米结构，平均直径约为500 nm（图1C和D）。由于单个C60富勒醇分子的直径约为1 nm，因此它们在水中的氢键作用下容易聚集。DLS在389 ± 6 nm和424 ± 74 nm处分别测量了100和200 mg L–1的C60富勒醇的流体力学直径；这些值类似于通过TEM获得的值。此外，NPs高度带负电，100和200 mg L-1的zeta电位分别为-39.5 ± 2.5 mV和-43.7 ± 7.2 mV。由于水的极性，C60富勒醇的高度负电荷归因于NPs羟基的键伸展或去质子化。
图1 C60富勒醇的表征。
C60富勒醇聚集体的分子结构（A），红外光谱（B）和透射电子显微镜（TEM）显微照片，比例尺分别为200 nm（C）和100 nm（D）。
2. C60富勒醇的ROS清除能力
超氧阴离子（·O2-），过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）是在非生物和生物胁迫下植物中常见的ROS。表1显示，C60富勒醇以剂量依赖性方式降低·O2–，对于100和200 mg L–1 C60富勒醇，清除率分别为14％和30％。相关学者提出了通过C60衍生物清除·O2–的可能机制。但是，C60富勒醇显示出有限的催化活性来清除H2O2（1.7和2.7％），表明CAT模拟活性较弱。另外，C60富勒醇NPs具有快速而强大的·OH清除能力，在10分钟内对100和200 mg L–1的C60富勒醇具有20％和30％的羟基清除率。观察到的C60富勒醇的·O2–和·OH清除能力与以前的报告一致。相反，与C60富勒醇相比，原始C60富勒烯具有相对较弱的自由基清除能力（表1）。两者清除自由基能力的差异归因于表面化学诱导的电子亲和力差异。
表1 C60富勒醇和富勒烯C60的ROS清除能力
3. C60富勒醇对Cu诱导的氧化应激的性能
Cu被用作模型氧化应激信号发生器，因为Cu可以通过Fenton和Haber-Weiss型反应来催化ROS的形成。毫不奇怪，在暴露48 h后，每株5 mg Cu处理会引起叶片萎黄和衰老（图2I）。出乎意料的是，C60富勒醇不能减轻Cu诱导的黄瓜叶片毒性。实际上，C60富勒醇加重了植株叶片萎黄症状（图2I）。
暴露48h后，与对照组相比，两种浓度C60富勒醇均未引起MDA含量变化（图2II），表明两种浓度C60富勒醇未造成植株脂质过氧化。与未暴露的对照相比，暴露于Cu导致叶片中MDA含量显著增加（140％；p ≤ 0.05）。但是，两种浓度的C60富勒醇预处理均对Cu诱导的MDA形成没有影响，这加深了我们对表型观察的理解，即C60富勒醇不会缓解Cu诱导的黄瓜植株氧化应激。相反，与仅暴露于5 mg Cu/植物的植物相比，用1和2 mg/植物C60富勒醇预处理的植物似乎分别将MDA含量提高了19％（p = 0.09）和16％（p = 0.06）。
为了解释出乎意料的结果背后的机理，我们假设C60富勒醇通过改变膜组成或表皮渗透性而增加Cu向叶片的流入。为了验证这一假设，采用ICP-MS测定黄瓜组织中的Cu含量。结果表明，用C60富勒醇进行预处理以剂量依赖性方式显著增加了黄瓜叶片中的Cu积累（p ≤ 0.05）（图2III）。C60富勒醇可物理渗透脂双层并破坏细胞膜完整性。但是，结果表明，暴露于两种剂量的C60富勒醇均未发生细胞膜破坏（图2IV）。这表明C60富勒醇可能通过改变膜组成而增加Cu的流入，而不是通过对其造成物理伤害。C60富勒醇诱导的Cu吸收增加的另一种解释是通过“特洛伊木马效应”吸收了富勒醇与Cu的复合物。但是还需要研究C60富勒醇与Cu相互作用的附加实验。
图2 C60富勒醇对黄瓜毒性的影响
黄瓜叶暴露于不同剂量的C60富勒醇和Cu的表型图像（I）；黄瓜叶片中丙二醛含量（II）；黄瓜植株（叶+根）的生物量（III）；叶片组织中的Cu含量（IV）。A–F代表不同的处理组：（A）对照（既不使用C60富勒醇也不使用Cu）；（B）1 mg C60富勒醇/植物；（C）2 mg C60富勒醇/植物；（D）5 mg Cu/植物；（E）1 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu/植物；（F）2 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu/植物。暴露于1和2 mg C60富勒醇NP/植物中2天的黄瓜叶片的电解质渗漏（每天两次叶面施用）。数据是三个重复的平均值。误差棒代表标准偏差。
4. 黄瓜叶片的代谢组学
基于351种已鉴定和定量代谢物的数据集，一种非靶向高分辨率GC-MS方法证明了黄瓜叶片中的大量代谢变化。首先，进行无监督的PCA分析以生成组之间聚类信息的概述。PCA得分图显示，沿第一主轴（PC1）将Cu相关组（D，E，F）与非Cu组（A，B，C）明显分开，这解释了总变异性的25.4％（图 3I）。这表明Cu显著改变了暴露黄瓜植株中的代谢产物，这与我们先前的研究一致。但是，在PCA得分图中未观察到C60富勒醇（B和C组）与对照（A组）之间的明显分离。我们进一步采用有监督的PLS-DA分析来最大化组之间的分离。PLS-DA评分图（图3II）显示，C60富勒醇组（B和C）通常沿剂量依赖性方式沿PC2与对照组（A）分开，表明C60富勒醇单独改变了黄瓜叶片的代谢物谱。另外，尽管C60富勒醇的剂量比Cu的剂量低得多，但C60富勒醇（E和F）的存在以剂量依赖的方式改变Cu（D）诱导的代谢产物的分布（图3II）。还通过t检验筛选出显著变化的代谢物，结果显示在维恩图中（图4）。1 mg C60富勒醇（B），2 mg C60富勒醇（C），5 mg Cu（D），1 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu（E）和2 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu （F）的处理分别诱导了20、40、117、126和146的代谢物变化。
C60富勒醇以剂量依赖的方式显著降低了质膜的主要成分亚麻酸的含量（图S1）。质膜脂肪酸的下调是C60富勒醇改变细胞膜组成的有力指标。Yamauchi等人证明叶绿体是主要的细胞器，其中MDA由过氧化的亚麻酸生成。先前的研究表明，在胁迫或衰老过程中，叶绿体中的类囊体膜会分解，叶绿素和半乳糖脂会分解。随后，这导致有毒中间体如四吡咯，游离植醇和游离脂肪酸的积累。此外，暴露于1和2 mg/植物C60富勒醇中的植醇（叶绿素的降解产物）分别增加了37％和74％（图S1）。此外，响应于C60富勒醇暴露，几种抗氧化剂相关的代谢物，包括3-羟基黄酮（所有黄酮醇的骨架），4-乙烯基苯酚二聚体，1,2,4-苯三酚和奎尼酸被上调（图S1）。另一方面，在未暴露的黄瓜叶片中未检出氧化形式的抗坏血酸（维生素C，水溶性抗氧化剂）脱氢抗坏血酸（DHA），但在暴露于C60富勒醇的植株中DHA显著增加。总计，脂肪酸的下调和抗氧化剂分子的上调可能表明C60富勒醇以未知的机制触发了ROS的过量生成，这是一个非常有趣的发现，因为C60富勒醇应该作为外源抗氧化剂清除ROS。
图3 用不同剂量的C60富勒醇或Cu处理的黄瓜叶片的代谢物谱的主成分分（PCA）
（A）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）（B）得分图。彩色椭圆表示每组的95％置信区域。A–F代表不同的处理组：（A）对照（既不使用C60富勒醇也不使用Cu）；（B）1 mg C60富勒醇/植物；（C）2 mg C60富勒醇/植物；（D）5 mg Cu/植物；（E）1 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu/植物；（F）2 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu/植物。
图4 暴露于不同剂量的C60富勒醇或Cu的黄瓜叶片中代谢物的显著变化的维恩图。
A–F代表不同的处理组：（A）对照（既不使用C60富勒醇也不使用Cu）；（B）1 mg C60富勒醇/植物；（C）2 mg C60富勒醇/植物；（D）5 mg Cu/植物；（E）1 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu/植物；（F）2 mg C60富勒醇+ 5 mg Cu/植物。
5. 叶片的蛋白质组学分析
用基于相对和绝对定量的等压标记（iTRAQ）的蛋白质组学明确鉴定和定量了3125种蛋白质。其中，有286种蛋白质在暴露后差异表达，其中C60富勒醇上调165种，下调121种（倍数变化> 1.2或<0.87；p ≤ 0.05）（图5A）。首先，使用GO分析来深入了解C60富勒醇差异调节的蛋白质的生物学过程，分子功能和细胞定位。由C60富勒醇诱导的蛋白质调控变化分为10个生物过程类别，10个细胞成分类别和10个分子功能类别（图S2A）。另外根据KEGG途径分析对蛋白质进行了注释。结果表明，光合作用，丙酮酸代谢，碳代谢，柠檬酸循环，碳固定，乙醛酸和二羧酸代谢，糖酵解/糖异生，核糖体，卟啉和叶绿素代谢等10个途径得到了显著富集（图S2B）。OmicsBean蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络揭示出16种蛋白质和5种驱动蛋白主要参与能量代谢（图5B）。差异表达的蛋白质与光合作用和碳固定，能量和防御有关，将进一步讨论。
图5 定量蛋白质组学数据
（A）暴露于C60富勒醇的黄瓜叶片中286种差异调节（p < 0.05）蛋白质的火山图。红色和绿色的点分别代表上调（165）和下调的代谢物（121）。（B）差异表达蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用网络。
6. 光合作用相关蛋白
植物利用其光捕获系统和叶绿素捕获能量，随后驱动光合作用电子通过叶绿体的类囊体膜运输。数据表明，与C60富勒醇暴露后，与水光解作用和所有光合作用产生的电子有关的PSII蛋白被上调（2.19倍）。此外，C60富勒醇暴露后发现细胞色素b6/f介导电子从光系统II（PSII）到光系统I（PSI）的转移被上调（1.58倍）。此外，叶绿体ATP合酶利用光合作用电子传递产生的质子动力从ADP产生ATP。结果表明，与对照相比，叶绿体ATP合酶增加了1.63倍。光系统I（PSI）P700是一个例外，它因C60富勒醇暴露而降低（0.52倍）。该蛋白质的功能是接受来自PSII的电子并将NADP转移至NADPH。值得注意的是，所有上述蛋白质都是类囊体膜定位蛋白质，并参与电子的产生和运输。这些蛋白质的变化可能表明C60富勒醇影响光合作用过程。
与暴露于C60富勒醇的对照相比，叶绿素a/b结合蛋白（CAB），光捕获复合物（LHC）蛋白分别增加了1.4倍和2.7倍。此外，C60富勒醇将Mg-原卟啉IX螯合酶（Mg-PPIX，Mg-螯合酶）的丰度提高了1.46倍。Mg-PPIX螯合酶催化将镁离子插入原卟啉IX中，从而生成叶绿素前体Mg-原卟啉IX（Mg-PPIX）。因此，Mg-PPIX螯合酶的上调可能表明叶绿素生物合成的增强。在光系统II的光保护中起关键作用的细胞色素b559β亚基（Cyt. b-559β亚基）也因C60富勒醇暴露而被上调了3.24倍。这表明黄瓜叶片响应C60富勒醇的暴露，明显上调了叶绿素的生物合成，提高了光系统II中电子传递速率，并增强了光捕获。
C60富勒醇触发的类囊体膜定位蛋白变化的原因仍然未知。C60是电子的良好受体，具有可逆地容纳多达六个电子的能力。C60富勒醇对电子的接受能力可能归因于电子传递相关蛋白的变化。假定C60富勒醇接受来自PSII的电子。这触发了电子传递相关蛋白的上调，以补偿C60富勒醇捕获的电子。但是，需要进一步研究以阐明其潜在机制。
叶绿素荧光数据证实，从第2天到第5天，暴露于两种剂量的C60富勒醇的叶片中，电子传输速率（ETR）均显著增加（图6A）。加速的电子传输速率可能解释了过量产生的ROS，因为位于类囊体膜的PS II和PS I是ROS产生的主要部位。另外，黄瓜叶的SPAD单位（图6B）和PSII的最大量子产率（Fv/Fm；图6C）未因富勒醇暴露而改变。PSII（ΦII）的有效量子产率在对照和富勒醇处理的植株上，在24和72 h时显示出显著差异（图6D）。与对照相比，首次叶面施用后，暴露于富勒醇的叶子中的ΦII显著降低。这种趋势在第3天保持不变，这意味着高剂量的C60富勒醇显著提高了有效量子产率。
7. 能量和碳水化合物代谢
参与能量和碳水化合物代谢的蛋白质分为四类：糖酵解，磷酸戊糖途径，TCA循环及其他。糖酵解是一种代谢途径，可氧化葡萄糖以生成ATP，还原剂和丙酮酸。发现C60富勒醇暴露上调了催化糖酵解步骤的酶的表达，例如葡糖-6-磷酸异构酶（GPI；1.5倍）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH；1.8倍）（表2）。另外，TCA循环中涉及的三种蛋白质，包括乌头酸水合酶（Aconitase），琥珀酸辅酶A连接酶（SCoAL）和苹果酸脱氢酶（MDH），均会因C60富勒醇暴露而下调（0.33-0.67）（表2），表明了TCA周期的抑制。糖酵解，TCA循环和线粒体电子传递链参与植物的呼吸作用，这是对能量丰富的光合终产物（即淀粉和蔗糖）的受控氧化，以产生CO2和三磷酸腺苷（ATP）。与能量有关的代谢（如糖酵解和TCA循环）的扰动也可能与ROS的过量产生有关，因为以前的报告显示，氧化脂质，如多不饱和脂肪酸可以抑制TCA循环活性。
表2 暴露于2 mg /植物富勒醇的黄瓜叶片中显著变化的蛋白质
8. 保护，解毒和应激响应蛋白
ITRAQ分析表明，黄瓜暴露于C60富勒醇后，许多与解毒和应激防御有关的蛋白质的丰度上调。与对照相比，C60富勒醇下调了微粒体谷胱甘肽S转移酶（GST）和参与保护细胞膜免于氧化应激的酶。另外，铁蛋白的表达上调了2倍。铁蛋白是一种铁存储蛋白，在螯合或因需释放铁方面起着重要作用。除缓冲铁外，先前的研究还表明，植物铁蛋白可通过清除ROS保护细胞免受氧化损伤。半胱氨酸蛋白酶抑制剂（胱抑素）增加了2倍，有可能提高对具有半胱氨酸蛋白酶的病原体的抵抗力。
C60富勒醇暴露上调了与生育酚含量和氧化应激有关的生育酚环化酶（TC）。生育酚是一种强抗氧化剂，对于氧化应激期间清除ROS至关重要。TC是在叶绿体的内囊膜中合成的，并累积在所有叶绿体膜中，从而提供抗氧化降解的保护作用。生育酚生物合成的前体植醇与TC同时增加，这表明C60富勒酚诱导氧化应激并激活了抗氧化防御系统。
除上述抗氧化剂和解毒相关蛋白外，参与植物防御和疾病响应的肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIases或免疫亲和素）也因暴露于C60富勒醇而被上调。除抗氧化剂外，还发现有助于重折叠错误折叠蛋白的HSP 70被上调。乙烯和多胺的前体S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAM）上调了1.56倍。这表明C60富勒醇不仅可以增强光合作用，还可以激活防御系统，这与代谢结果一致。
结合代谢组学和蛋白质组学数据，提出了一个假设，即由C60富勒醇在光系统I（PSI）和光系统II（PSII）的反应中心诱导的加速电子传递触发了ROS的过量产生。植物上调抗氧化剂分子和防御相关蛋白，以保护类囊体免受损害。ROS的过量产生也引起了碳代谢的扰动。
9. 环境影响
在这项研究中，碳基纳米材料C60富勒醇被用作外源抗氧化剂，以减轻Cu诱导的黄瓜植物氧化应激。出乎意料的是，C60富勒醇通过增强Cu向细胞中的流入而增强了Cu在黄瓜植株中的毒性。尽管未观察到视觉毒性症状，但代谢组学研究表明，C60富勒醇诱导了叶片中的代谢网络重编辑，包括脂肪酸的下调和低分子量抗氧化剂化合物的上调（图解1），这表明了膜成分的改变和应激响应。蛋白质组学分析表明，C60富勒醇上调了参与水光解，电子传输，光捕获，和色素固定的叶绿体膜蛋白。此外，C60富勒醇干扰了能量相关的途径，包括糖酵解相关蛋白的上调和TCA循环相关蛋白的下调（图解1）。叶绿素荧光实验证明，C60富勒醇能够提高黄瓜叶片中的电子传递速率。全面了解C60富勒醇引起的分子变化背后的潜在机制可能使它们将来在农业中安全可持续地使用。
图解 总结图解显示了在代谢产物和蛋白质水平上检测到的C60富勒醇在黄瓜叶片中引起的主要变化a
a斜体显示统计学差异调节的代谢产物和蛋白质，红色表示上调，绿色表示下调。