科研| J CLIN MED：代谢组学揭示了儿童哮喘患者血浆和尿液中与IgE反应相关的不同特征
编译：冬日暖阳，编辑：谢衣、江舜尧。
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哮喘和其他变态反应性疾病是多种遗传因素与各种环境刺激之间相互作用的结果。暴露于IgE致敏的变应原是哮喘发作的关键环境决定因素，涉及多种细胞和分子介质。应用代谢组学揭示了哮喘的代谢特征，并在分子水平上为哮喘概况分析提供了新的见解，但目前仍然缺乏对儿童早期哮喘的血液和尿液的综合分析。本研究使用NMR结合PLS-DA进行对28例哮喘儿童和26例健康对照者的血浆和尿液样品进行了代谢组分析，得到IgE和食物致敏儿童的血浆和尿液代谢产物的显著差异代谢物，反映了不同的代谢途径。血浆丙酮酸代谢成乙酸似乎与血清IgE的产生有关，而尿中的支链氨基酸代谢主要反映了食物对过敏的过敏反应。本文为儿童哮喘的代谢图谱提供了更详细的信息，同时鉴定了对哮喘治疗潜在重要的代谢物生物标志物。
论文ID
原名: Metabolomic Analysis Reveals Distinct Profiles in the Plasma and Urine Associated with IgE Reactions in Childhood Asthma
译名:代谢组学揭示了儿童哮喘患者血浆和尿液中与IgE反应相关的不同特征
期刊: Journal of Clinical Medicine
IF: 5.688
发表时间:2020.3
通讯作者: Chih-Yung Chiu、Gigin Lin
通讯作者单位:台湾林口长庚纪念医院
实验设计
样本采集：对3至5岁被诊断患有哮喘的患儿和健康对照的儿童采集血浆和尿液，收集有关人口统计数据、家庭特应性史、被动吸烟和与特应性疾病有关的家庭收入的信息。对采集的受试者的血清样品检测总血清和过敏原特异性血清IgE水平。通过ImmunoCAP测量总血清IgE水平，并使用商业化的IgE测定法确定食物（蛋清和牛乳）和吸入性（Dermatophagoides pteronyssinus和Dermatophagoides farinae）过敏原的特定IgE水平。变应原特异性IgE水平≥0.35 kU / L被定义为阳性并表示变态反应致敏。
代谢组分析血浆和尿液样品制备：将500μL血浆与500μL磷酸盐缓冲液在含有TSP的氘水溶液中混合，涡旋20 s，并在4℃以12000g离心30分钟，取600μL上清液转移至NMR管中进行分析。
1H–核磁共振（NMR）分析及数据处理：使用Bruker Avance 600 MHz光谱仪进行，自由感应衰减64K数据点，谱宽10,000 Hz，64 次扫描。然后将获得的1H-NMR光谱进行手动定相，进行基线校正，并使用TopSpin 3.2软件将化学位移参考为TSP。导入NMRProcFlow软件处理，进行校准、基线校正、对准、光谱存储和数据归一化。通过使用Chenomx NMR Suite 8.1软件鉴定代谢物。使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行分组，选择在VIP得分上≥1.0或p值<0.05的代谢物，并利用KEGG分析功能性代谢途径。
实验结果
患者基本情况
共有54名儿童（28名哮喘病患者和26名健康对照者）参加了这项研究。哮喘患儿与健康对照者的特征差异见表1。特应性指标包括总血清IgE水平和对屋尘螨D. pteronyssinus和D. farinae的过敏原特异性IgE水平，但不包括蛋清或牛奶，哮喘患儿的患病率显着高于健康对照组（p = 0.001）。性别、孕产妇年龄、母亲疾病、被动吸烟和家庭收入均无差异。
表1.本研究中调查的54名儿童的流行病学特征
根据哮喘和螨、食物和IgE敏感性分类的代谢物集
1H-NMR分析血浆和尿液获得34种和44种已知代谢物。表2显示了哮喘患者和对照组之间以及螨虫、食物和IgE致敏的儿童之间具有显著差异表达的代谢物和表达水平的倍数变化。与健康对照组相比，哮喘患儿血浆组氨酸水平明显升高，而尿中的1-甲基烟酰胺和三甲胺N-氧化物（TMAO）的水平较低。与没有致敏的儿童相比，IgE和食物致敏儿童分别有11（92％）的血浆代谢物和8（80％）的尿代谢物具有显著差异。
表2.哮喘患儿和对照组以及有无螨虫、食物和IgE致敏的患儿之间的代谢物的VIP评分和倍数变化差异显著
血浆和尿液代谢产物之间的关联
血浆和尿液代谢物之间的Spearman等级相关系数如图1所示。血浆焦谷氨酸、3-羟基丁酸和丙酮与大多数尿液代谢物呈强负相关，而丙二醇呈正相关。其中，血浆3-羟基丁酸与尿液3-甲基-2-氧代戊酸、3-羟基异戊酸、2-羟基异丁酸、3-羟基异丁酸和丙氨酸高度相关。此外，血浆亮氨酸、酪氨酸和缬氨酸也与尿液中的3-羟基异戊酸、2-羟基异丁酸和丙氨酸有很强的相关性。对于血浆和尿液中都存在的代谢物，肌酸和赖氨酸呈负相关。
图1.血浆和尿液代谢物之间Spearman等级相关系数的热图。颜色强度代表相关程度。红色=正相关；蓝色=负相关。+符号表示p值<0.05；++符号表示p值<0.01
血浆和尿液代谢组间特应性指标相关代谢产物的关联
进一步比较血浆和尿液代谢组之间与特应性指数相关的差异代谢产物的相关性，结果显示哮喘相关血浆组氨酸与任何尿液代谢产物均不相关，而尿液1-甲基烟酰胺和TMAO与血浆甘露糖和赖氨酸呈强正相关。与血浆IgE致敏相关的缬氨酸和赖氨酸分别与2-羟基异丁酸和3-羟基异戊酸显着负相关。相反，食物致敏相关的尿液3-甲基-2-氧代戊酸和3-羟基异丁酸分别与血浆焦谷氨酸和3-羟基丁酸呈显着负相关
与过敏原特异性IgE水平相关的特应性指标相关的代谢物
血浆、尿液代谢物的特应性指数与总血清IgE和过敏原特异性IgE水平的相关性如图2所示。总血清IgE水平与屋尘螨D. pteronyssinus、D. farinae、蛋白、牛奶的特异性IgE水平显著正相关（p <0.01）。其中，发现D. pteronyssinus和D. farinae的特异的IgE水平之间存在很强的相关性，蛋白和牛奶中的IgE特异水平之间存在很强的相关性，但螨虫和食物过敏原的IgE特异水平之间却没有发现这种相关性。但是，与IgE致敏有关的血浆代谢物与总血清IgE和过敏原特异性IgE水平无关。相反，大多数与食物敏感性相关的尿液代谢产物与总血清IgE和蛋清特异性IgE水平显着正相关（p <0.05）。此外，与哮喘相关的尿液TMAO与赖氨酸和蛋氨酸显着相关，而尿液1-甲基烟酰胺与乙酸和乳酸显着相关。
代谢途径与功能分析
与过敏致敏有关的代谢功能途径见表3。与健康对照相比，过敏儿童的血浆糖酵解或糖原异生与丙酮酸代谢和尿液氨基酸代谢显着相关。在血浆丙酮酸代谢中发现丙酮酸和乳酸水平降低，同时乙酸水平升高。分别在尿液缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径和苯丙氨酸代谢中发现亮氨酸、缬氨酸和3-羟基异丁酸水平升高，3-苯基丙酸酯、N-苯基乙酰基甘氨酸和酪氨酸水平升高。
表3.与儿童哮喘过敏致敏有关的代谢物的代谢途径和功能分析
讨论
利用代谢谱分析已成功鉴定出某些代谢产物与哮喘有关。但是，不同的疾病状态的样本类型具有独特的代谢特征。本文提供了儿童哮喘的血浆和尿液的综合。
通过人体循环的血液携带着许多小分子代谢物，这些代谢物是由生物体和外源性化学物质（包括药物、食品和环境过敏）产生的。而肾脏在从血液中提取水溶性废物以及各种其他过量化合物，产生尿液。结合蛋白的代谢物可能无法通过肾小球完全滤除，并且活跃的肾小管分泌和再吸收也可能影响尿液中代谢物的水平。这可能是本研究中血浆和尿液中都存在代谢产物之间没有强烈关联的原因。
3-羟基丁酸是由乙酰辅酶A在肝脏中合成的脂肪酸和生酮氨基酸（如亮氨酸和异亮氨酸）的代谢产物。在这项研究中，观察到血浆3-羟基丁酸与尿液中的羟基酸之间存在强而显着的相关性。
与之前研究相同，本研究中总血清IgE水平与螨虫和食物的特定IgE水平密切相关。但在血浆中，大多数差异代谢物是在IgE致敏的儿童中发现的。观察到乙酸和缬氨酸水平升高的同时血浆丙酮酸通过乙酰辅酶A代谢，可能在对过敏反应的血清IgE产生中起作用。
与血浆相比，食物致敏的儿童尿液代谢物显着差异，并且与总血清IgE水平相关，表明尿液代谢组可能主要反映营养状况、饮食摄入和过敏结果。此外，与食物致敏有关的尿液代谢物3-羟基异丁酸和3-甲基-2-氧代戊酸分别是缬氨酸和异亮氨酸代谢的中间产物。本研究中尿液中缬氨酸、亮氨酸和羟酸水平的增加表明支链氨基酸代谢可能会影响对食物的过敏反应。
代谢组学分析和尿液样品分析已成功鉴定出与哮喘相关的微生物衍生代谢物。本研究中，尿液TMAO是肠道细菌产生的代谢物，与食物过敏和儿童哮喘有关。此外，尿液中N-苯基乙酰甘氨酸是一种肠道微生物的协同代谢物，与总血清IgE水平和食物过敏原特异性IgE水平密切相关。因此，利用饮食依赖的代谢途径对肠道菌群的营养不良可能是确定人类患过敏性疾病敏感性的关键。
组氨酸是一种必需氨基酸，可产生组胺，而组胺在哮喘患者的急性过敏反应中起着重要作用。相反，饮食中烟酸的代谢产物1-甲基烟酰胺与哮喘以及血浆甘露糖密切相关。甘露糖结合凝集素是先天免疫中的重要蛋白质，在结合甘露糖后调节炎症反应，并通过引起气道炎症与哮喘有关。据报道1-甲基烟酰胺对哮喘加重具有保护作用，其可能的机制其与甘露糖结合凝集素水平有关的抗炎作用相关。
代谢组学可用于识别参与调节哮喘的复杂机制的生物标志物和途径。本研究的主要局限性是使用1H-NMR时相对较小的样品量和对丰度较低的代谢物（<100 nmol/L）灵敏度低。但1H-NMR具有高重现性。最重要的是，血浆和尿液代谢组的综合分析可提供有关过敏性疾病的更全面的代谢信息。
评论
通常使用血浆和尿液代谢组学评估导致人类疾病的分子机制。尿液通常包含来自多种食品和药物的代谢分解产物，而血液包含代谢活性化合物和尿中不存在的脂溶性代谢产物。本文对儿童哮喘的血液和尿液中代谢反应进行综合分析，反映出在过敏反应中不同的代谢途径，血浆中能量代谢和氨基酸代谢似乎与血清IgE有关，而尿中支链氨基酸的代谢主要反映了食物过敏反应。检测到的的食物致敏有关的微生物-宿主共代谢物也表明肠道微生物营养不良对过敏的影响。但更全面的解析这种关联仍需要进行进一步的功能研究。
原文网址：https://doi.org/10.3390/jcm9030887