MCP | 磷酸化蛋白质组学分析揭示人类精子细胞中KOR下游精子特异性蛋白变化
推荐：江舜尧
编译：微细胞
编辑：马莉
从90年代初期开始实施的人类基因组计划，在经过各国科学家近10年的努力下，已经取得了巨大的成就。然而，知道了人类的全部遗传密码，即基因组序列，就可以任意控制人的生老病死吗？其实并不是这么简单。所以，随着人类基因组计划的逐步完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组学（proteome）研究。蛋白质组学研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是，蛋白质组学的研究可深入分析蛋白质间相互作用及蛋白质的功能。
西班牙巴斯克国立大学生理学系ItziarUrizar-Arenaza 等人于蛋白质组学期刊Mol Cell Proteomics（MCP）发表磷酸化蛋白质组学分析文章，通过磷酸化蛋白质组学分析揭示了人类精子细胞中KOR下游的精子特异性蛋白变化，研究发现，G蛋白偶联受体（GPCRs）下游的分子机制中具有独特的特征，GPCRs可能是精子生育的关键调节器，而对这些过程的认识提高，可有助于为男性不孕的诊断和治疗开发进行指导。
哺乳动物精子细胞是不成熟的，必须经过许多生理和生化的修饰，才能达到受精能力。这些过程，如获得精子活力、获能、超活化和顶体反应，依次发生在女性生殖道内，被认为是控制生殖的关键所在，也是精子繁殖的必要条件。在过去十年中，在人类精子细胞中大量GPCRs研究表明，代谢机制在获得精子受精能力方面也可能有着很重要的作用。
G蛋白偶联受体（GPCRs）属于七个跨膜受体超家族，通过G蛋白对外界刺激的反应来传递信号，从而启动细胞内不同的信号通路，最终形成特定的细胞反应。不同GPCRs在人精子质膜上的表达，也反映了它们参与精子生育的调控。然而，精子中GPCRs下游信号通路还未完全了解，本文用κ型阿片受体（KOR）作为研究模型，并应用了基于TMT标记和LC-MS/MS分析的磷酸化蛋白组学研究方法，对超过5000个具有3500个磷酸化位点的蛋白质进行分析，并揭示了精子特异性蛋白的磷酸化水平的变化，这些蛋白参与了KOR激动剂—u50488h的精子生殖调节。进一步的功能研究表明，KOR可能通过调节钙通道，参与调节精子繁殖能力，研究结果表明，人类精子在GPCRs下游的分子机制中具有独特的特征，GPCRs可能是精子生育的关键调节器，而对这些过程的认识的提高可能有助于为男性不孕的诊断和治疗开发进行指导。
基于化学标记的蛋白质组学研究鉴共定出5109种精子蛋白，其中5070种被定量。尽管Amaral等人提出了最完整的人类精子蛋白质目录中有6198个报告的蛋白质ID，在本研究中，已经确定了超过68%的精子蛋白质组，因为估计人类精子由7500种不同的蛋白质组成。
人类精子在GPCRs下游的分子机制中具有独特的特征，可有助于开发用于诊断和治疗男性不孕。此外，它还可以为生殖管理提供一个创新的机会，通过开发新的靶向避孕药来提高或减少受精的可能性。
图1.蛋白质组学与磷酸化蛋白组学示意图
图2. 基因本体分析（panther bio-informatic tool）显示了研究中确定的总蛋白的生物学过程。总I类磷（P-位点）和相应蛋白质。所有量化磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。基因本体分析，表明属于I类位点磷酸化位点及韦恩图富集显示
图3. U50488H对人精子磷蛋白组的影响。经1分钟和60分钟U50488H处理后，作为可溶性和不溶性蛋白质组分U50488H/对照组（p值<0.05）的–log2统计显著性的函数，总体log2 U50488H/对照组的TMT倍数变化。蓝色表示下调磷酸化位点U50488H。红色表示U50488H上调磷酸化位点
图4。KOR在人类精子生理学中的作用。1分钟和60分钟U50488H（1μm）治疗对人类精子运动、获能和顶体反应的影响。WB显示1分钟和60分钟U50488H处理后蛋白激酶C磷酸化底物的表达。n＝3。（**p<0.01 vs.对照组）。使用CASA（计算机辅助精子分析仪）系统对进行性、非进行性、不动性和过度活动性运动中的1分钟和60分钟U50488H治疗进行运动分析
图5。人精子中KOR下游高活性运动和顶体反应钙的研究。U50488h（1μm）与：nnc-55-0395（10μm），catsper抑制剂；mibefradil（30μm），钙通道激活剂和U73122（3μm），PLC抑制剂U50488H（1μm）与：NNC-55-0395（10μm）、米贝格雷（30μm）和U733122（3μm）共孵育60分钟，研究顶体反应。以U50488h（H2O）（对照样品）和u50488h（1μm）为溶剂，在加载fura-2的人类精子细胞中进行细胞内游离Ca2+测量。随后在同一精子中加入30μm的米贝格雷作为钙通道激活剂和1μm孕酮。孕酮引起典型的双相[Ca2+]i孕酮反应。x轴以秒为单位显示时间，y轴以fura-2比率变化表示[Ca2+]i
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