【LorMe周刊】知己知彼：青枯菌群体感应信号合成与调控的特异性

作者：张晓晖，南京农业大学硕士在读。主要研究青枯菌多态性与动态阻控。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍青枯菌phc群体感应系统中信号的产生及其响应特异性。原文于2019年发表于《ACS Chemical Biology》。

导读

与其他致病微生物一样，青枯菌也具有社会性，它通过信号分子的合成、识别与转导进行交流。其中，phc群体感应（QS）是青枯菌感知种群数量、实现种内通讯、调控侵染致病的重要机制。因此，深入了解QS系统及其信号分子的合成与调控是精准控制青枯菌毒力的前提。青枯菌的QS系统由phcBSR操纵子组成，主要合成3-羟基肉豆蔻酸甲酯（3-OH MAME）或3-羟基棕榈酸甲酯（3-OH PAME）两种QS信号分子。然而青枯菌的遗传多样性十分丰富，不同菌株合成的QS分子是否相同、能否通用，均不清楚。日本大阪府大学Kenji Kai团队，以15个代表性青枯菌菌株为对象，从生化、酶动力学、分子生物学等手段，探究了青枯菌QS分子合成与调控的特异性。发现PhcB和PhcS决定了青枯菌合成并感知哪种QS信号分子，且不同菌株的信号分子不能共用。该研究进一步证明了青枯菌进化的复杂程度，为青枯菌的精准防控提供了思路。

科学问题：

青枯菌群体感应信号产生的选择性生化机制及响应特异性。

研究思路：

作者首先通过对来自15个青枯菌菌株的信号合酶PhcB和信号受体PhcS进行系统发育分析发现，PhcB甲基转移酶利用同源脂肪酸（R）-3-OH MA或（R）-3- OH PA来合成QS信号，并通过构建体外酶法，证实3-OH MA和3-OH PA确为PhcB酶的底物，分别合成3-OH MAME和3-OH PAME这两种phc QS信号分子，接着通过试验确定PhcB酶的底物特异性和底物对映选择性，再通过掺入试验确定两种信号分子及其前体源于糖酵解和其后的FAS途径，最后分析了青枯菌菌株对3-OH MAME / 3-OH PAME的不同响应及特异性QS信号对于毒力的必要性。

青枯菌 phc群体感应系统

青枯菌通过伤口侵入植物根部的细胞间隙，然后分泌纤维素分解酶使植物导管细胞破裂，在繁殖的同时分泌胞外多糖（EPS），进而堵塞植物木质部导管，最终引起植物枯萎和死亡。EPS的产生受到phc调控元件组成的phc QS系统的调节。许多青枯菌菌株有选择地采用3-OH MAME或3-OH PAME作为其phc QS信号，如青枯菌的代表性模式菌株GMI1000和日本分离株OE-1-1能够产生3-OH MAME，而K60（美国）和8107（日本）能够产生3-OH PAME，两种信号分子及其前体来源于糖酵解和随后的脂肪酸合成（FAS）途径（图1）。

图1  青枯菌菌株phc QS信号及其前体的拟定生物合成途径

一、构建体外酶法，检测PhcB酶底物及其特异性

为检测PhcB酶的底物，作者构建了体外酶法，使用底物候选物（3-OH MA、3-羟基肉豆蔻酰基-ACP和3-羟基肉豆蔻酰基-CoA）、SAM和phcB基因缺失突变体ΔphcB_OE1-1的蛋白提取物进行了酶测定（图2B）。最后从3-OH MA的反应混合物中检测到少量的3-OH MAME，而添加了ΔphcB_OE1-1蛋白提取物能够诱导phcB_OE1-1的活性。除此之外，phcB₈₁₀₇和phcB_K60在ΔphcB_OE1-1蛋白提取物的存在下，也能将（R）-3-OH PA转化为（R）-3-OH PAME（图2C），说明这些酶的底物是3-OH MA 或3-OH PA，并仅在未知的辅助因子存在下才能发挥作用，且这些辅助因子没有菌株特异性。作者还使用（R）-3-羟基脂肪酸进行体外酶分析，发现不同菌株PhcB甲基转移酶选择性对不同底物具有不同强度的活性（图3A），同时其产生的两种底物量无显著差异（图3B），说明PhcB酶具有底物选择性特异性。除此之外，作者还发现PhcB酶具有底物对映选择性，其底物和产物均主要为（R）-对映体（图3C、D）。

图2  phc QS信号的化学结构和PhcB酶的甲基转移酶活性

图3  青枯菌菌株中3-OH MAME / 3-OH PAME生物合成的生化分析

（A）PhcB_OE1-1，PhcB₈₁₀₇和PhcB_K60酶的底物特异性。底物均为（R）-对映异构体。（B）由菌株OE1-1、8107和K60产生的3-羟基脂肪酸水平。（C）PhcB酶的甲基转移酶活性的对映选择性。（D）由青枯菌菌株产生的3-OH MA / 3-OH PA的手性LC / MS分析。3-OH LA：3-羟基月桂酸。3-OH SA：3-羟基硬脂酸。

二、phc QS信号分子前体产生途径

作者通过掺入试验，发现PhcB酶的底物可能由同源的3-羟基脂肪酰基ACP（FAS途径产物）合成（图4C）。向菌株OE1-1培养物中添加2-β-溴辛酸（BA）（一种脂肪酸的β-氧化循环抑制剂），发现BA以剂量依赖性方式引起3-OH MA和3-OH MAME的积累（图4D）。说明FAS途径可以提供这些物质，从菌株K60的实验中获得了相似的结果（图4E）。FAS途径的碳源主要来自糖酵解，OE1-1菌株（图4F）和K60菌株（图4G）能够在¹³C₆标记的D-葡萄糖/ D-半乳糖和BA存在下生长，说明phc QS信号及其前体源自糖酵解和随后的FAS途径。

图4  菌株OE1-1和K60的phc QS信号的来源分析

三、青枯菌菌株对3-OH MAME或3-OH PAME的不同响应及其毒力比较

作者通过微量滴定板检测并发现3-OH MAME / 3-OH PAME对ΔphcB_OE1-1和ΔphcB_K60（phcB缺失突变体）的生物膜形成、次级代谢产物（呋喃酮和青枯菌素）和EPS I产生的影响（图5），说明菌株特异性QS信号可以激活phc QS系统并影响菌株毒力表达。作者接着通过RNA-Seq转录组分析，发现phcB缺失突变体中涉及EPS I、呋喃酮、青枯菌素、编码凝集素、AHL、细胞壁降解酶等生物合成的多个基因表达水平显著降低，还有一些与细胞运动性、趋化性和hrp等相关的基因表达上升，而3-OH MAME或3-OH PAME（1μM）能够不同程度的弥补这些变化（前者远高于后者）（图6A）。表明菌株OE1-1对3-OH MAME和3-OH PAME的转录反应不同，并优先响应其自身3-OH MAME QS信号。最后作者通过对菌株的毒力进行比较，发现相比菌株OE1-1，ΔphcB_OE1-1及phcB₈₁₀₇-comp的毒力显著降低，而phcB_OE1-1-comp的毒力与OE1-1相似（图6B）。表明通过菌株特异性phcB基因激活phc QS对于青枯菌发挥毒力作用是必不可少的。

图5  菌株OE1-1和K60对3-OH MAME和3-OH PAME的响应差异

图6  3-OH MAME和3-OH PAME诱导的ΔphcB_OE1-1的基因表达谱和毒力的比较

      总结

本文阐明了几种青枯菌菌株的phc QS系统中信号的产生及特异性响应的生化机制。发现PhcB酶的底物确为3-OH MA和3-OH PA，只有在未知辅助因子的存在下才能转化为对应的QS信号分子（3-OH MAME或3-OH PAME），并且辅因子对青枯菌不是特异的。PhcB酶具有底物特异性和底物对映选择性，能够选择性产生QS信号分子。信号分子及其前体源自糖酵解和随后的FAS途径。特异性QS信号能够激活多种生理生化反应（如生物膜、次级代谢产物、EPS I的产生）和QS系统，是毒力发挥作用过程中必不可少的环节。不同青枯菌菌株对特异性QS信号分子转录反应不同，并优先响应其自身特异性QS信号。PhcB / PhcS蛋白的系统发育数据没有显示其寄主偏好性，因此可以通过结构生物学实验（例如PhcS蛋白的X射线晶体分析）来解释PhcS蛋白识别其自身/相反QS信号的特异性机制，进而为在信号产生、传递或识别的过程中对青枯菌毒力进行调节和抑制以及进一步开发田间防控青枯菌的生物技术提供理论基础。

论文信息

原名：Signal Production and Response Specificity in the phc Quorum Sensing Systems of Ralstonia solanacearum Species Complex

译名：青枯菌phc群体感应系统中信号的产生及响应特异性

期刊：ACS Chemical Biology

IF₂₀₁₉：4.434

发表时间：2019.09

通讯作者：Kenji Kai

通讯作者单位：大阪府大学生命与环境科学研究所