小麦BSR-Seq分析:郑麦103抗条锈病基因YrZM103定位
小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的叶部病害,是中国及世界小麦产区最重要的真菌病害之一。自1949年以来,我国曾发生4次(1950、1964、1990和2002年)小麦条锈病大流行,导致当年小麦产量损失超过1.0×109kg。小麦抗病品种在条锈病防治中发挥了极其重要的作用,目前已经从小麦及其近缘物种中发现了70多个小麦抗条锈病基因或等位基因,正式命名编号从Yr1至Yr83。由于条锈菌变异和新毒性菌系的产生,特别是强毒性菌系CYR33和V26出现以后,部分小麦品种中的抗条锈病基因丧失了抗性,如人工合成小麦后代川麦42所携带的抗条锈病基因YrCH42已丧失对条锈菌系V26的抗性,6VS/6AL易位系和贵农号品系所携带的全生育期抗性主效基因Yr24/Yr26也已开始感病,对我国小麦生产造成了巨大威胁。因此,发掘和利用新的抗条锈病基因、开发与其紧密连锁的分子标记并应用于培育新的抗病品种对条锈病的持久防治具有重要意义。
集群分离分析(BSA)结合转录组测序(RNA-Seq)是一种快速定位基因的新方法,通过在分离群体中选择极端性状的个体构建两个混合池,提取混合池RNA进行转录组测序,根据混池个数和物种的基因组大小来设定测序层数,最后通过经典贝叶斯算法分析转录组数据,开发SNP标记,预测目标基因所在的基因组区段。该方法在四倍体硬粒小麦遗传背景下找到了与高蛋白基因GPC-B1紧密连锁的SNP标记,在普通小麦遗传背景下成功用于开发与抗条锈病基因Yr15紧密连锁的分子标记。
郑麦103由河南省农业科学院小麦研究所育成的新品种,2014年通过河南省审定(豫审麦2014019),2019年通过国家审定(国审麦20190023),其系谱为“周麦13/(郑8904-7-1/郑麦004)”。该品种综合农艺性状好,高抗条锈病(图1),但其条锈病抗性遗传基础却不甚清楚。为此,我们对郑麦103的抗条锈病基因进行了抗病性遗传分析,并利用BSR-Seq方法进行分子标记定位,构建遗传图谱为精细定位和克隆该抗病基因,以及分子标记辅助选择育种奠定基础。
图1 郑麦103(YrZM103)的条锈病抗性表现(甘肃省清水县 2021)
1. 郑麦103抗条锈病基因的遗传分析
2015年3月中旬,在诱发行上接种3个条锈病菌CYR32、CYR33和CYR34(V26)的混合菌系,2015年5月下旬待诱发行严重感病时进行条锈病成株期抗性鉴定,每个家系单株的条锈病抗性反应型按6级记载,鉴定级别依次是免疫(0)、近免疫(0;)、高抗(1)、中抗(2)、中感(3)、高感(4),并用“ ”、“-”表示发病程度,根据家系单株的抗性反应型及其分离情况,推断该家系抗病基因位点的纯合或分离特性。
结果显示,成株期郑麦103为免疫,农大399为高感,农大399/郑麦103杂种F1代表现抗病,表明郑麦103的条锈病抗性呈显性遗传。其后代214个F2:3家系中有68个家系表现纯合抗病,75个家系表现抗病性分离,71个家系表现纯合感病,经卡方检验偏离1:2:1显性单基因遗传的分离比例(表1)。
2. BSR-Seq分析
根据农大399/郑麦103的F2:3家系条锈病抗性分离特点,分别选取20个纯合抗病和20个纯合感病F2:3家系的种子种植于穴盘中,待幼苗长到两叶一心期时,从每个家系取等量叶片分别构建抗、感混合池提取RNA,用Illumina Hiseq 2000进行RNA-Seq,之后对转录组数据进行质量控制,比对和过滤,最终对SNP进行变异挖掘,寻找与抗、感显著相关的候选SNP位点,用于标记开发,预测目标基因所在的基因组区段。
BSR-Seq分析结果表明,通过质量控制,抗病池和感病池转录组测序数据两条双末端Read都保留下来的比例超过99%,每个样本过滤后的数据总量在15 Gb左右。在抗感池转录组数据间找到 345,524个SNP,其中高质量SNP有107,939个,在各染色体上的数量和各染色体大小成正比。经过生物信息学分析,筛选出30个可能与郑麦103中抗条锈病位点相关的候选SNP位点,分布于小麦7条染色体上,其中有8个SNP位点位于2BS染色体上,8个SNP位点位于7BL染色体上(图2)。
图2 与郑麦103抗条锈病基因相关候选SNPs位点在染色体上的分布
3. SNP标记开发与抗条锈病基因连锁图谱构建
依据BSR-Seq分析结果,将候选SNP标记所在的Contig序列与小麦基因组测序数据库和粗山羊草D基因组数据库进行比对,寻找同源的Contigs序列,经综合比较分析,利用Primer3软件在线平台上(http://primer3.ut.ee)设计特异性引物。首先利用分布在2BS和7BL染色体上的SNP位点开发设计SNP标记,分别在抗、感亲本和抗、感F2:3家系中进行验证。结果发现,位于2BS染色体的候选SNP位点开发出的多态性标记在抗、感亲本间均存在多态性,但经在F2:3家系分离群体中验证,发现这些SNP标记的多态性与条锈病抗性并不连锁。
利用7BL染色体上的候选SNP位点开发标记,发现ZM215、ZM221、ZM229、ZM639、WGGC7051和WGGC13073在抗、感亲本和F2:3家系分离群体中抗病、感病家系间存在多态性。利用这6个多态性分子标记对农大399´郑麦103的214个F2:3家系进行基因型检测,其中ZM215、ZM221、ZM229、WGGC7051和WGGC13073的多态性可以通过凝胶电泳检测(图3),ZM639的多态性可以通过Sanger测序来检测(图4)。据此构建了郑麦103抗条锈病基因遗传连锁图谱,将郑麦103抗条锈病基因定位在7BL染色体上,命名为YrZM103,介于分子标记ZM221与ZM215之间18.7cM的遗传区间(图5)。
图3 与郑麦103抗条锈病基因YrZM103连锁的多态性分子标记PCR扩增结果
M:D2000; 1: 郑麦103; 2: 农大399; 3~7:纯合抗病家系; 8~12: 纯合感病家系; 13~17:分离家系
图4 分子标记ZM639在抗感亲本上扩增出的序列比对
利用农大399/郑麦103的F2:3分离群体,通过田间成株期条锈病抗性鉴定分别构建抗、感混合池进行RNA-Seq,经过BSR-Seq分析快速确定了郑麦103中抗条锈病基因可能位于2BS和7BL染色体区段,并筛选出多个可能与抗条锈病基因相关连的SNP位点,用于开发分子标记。经多态性分子标记筛选和进行分离群体验证,证实郑麦103的抗条锈病基因YrZM103位于7BL染色体上分子标记ZM221和ZM215之间18.7cM的遗传区间。由于这些标记为通过RNA-Seq分析找到的SNP标记,来源于基因的表达序列,因此便于后续利用短柄草和水稻等基因组序列进行比较基因组分析,开发新的分子标记,进而加密遗传连锁图谱,缩小目标基因定位区间。尤其是普通小麦品种中国春基因组测序完成后,可以快速利用这些SNP标记找到YrZM103在7BL染色体上的基因组区段,对YrZM103进行精细定位和克隆。传统的BSA分析筛选与目标基因连锁的SSR或EST标记通常需要进行PCR扩增、凝胶电泳和大量的多态性引物筛选,以确定目标基因可能所在的染色体(臂),再进一步开发该染色体区段的多态性分子标记加密遗传图谱。采用BSR-Seq的策略可以快速确定目标基因可能所在的染色体(臂),并同时提供大量的多态性SNP位点信息用于多态性标记开发和遗传图谱加密。随着测序成本的不断下降和小麦参考基因组序列的释放,BSR-Seq方法将会越来越广泛地应用于小麦目标基因定位。
4 YrZM103与7BL上其他抗条锈病基因位置比较
小麦7BL染色体末端已定位的抗条锈病基因有Yr52、YrZH84和YrC591。利用与这些已知基因连锁的多态性分子标记在农大399/郑麦103分离群体上进行验证,发现Xgwm577、Xbarc32、Xwmc273和Xcfa2040在郑麦103与农大399间存在多态性,并与YrZM103连锁,经分离群体分析,分子标记Xgwm577等均位于YrZM103的近端粒侧(图5)。
图5 YrZM103与Yr52、YrZH84和YrC591基因遗传连锁图谱的比较
目前在已正式命名和暂时命名的小麦抗条锈病基因中,Yr52、YrZH84和YrC591均位于7BL上。选取与这3个抗条锈病基因连锁的分子标记在YrZM103遗传群体上进行检测,其中4个标记(Xgwm577、Xwmc273、Xcfa2040和Xbarc32)可整合到YrZM103连锁图谱上,但均位于YrZM103的近端粒一侧(图5)。与此相反,这4个标记却位于Yr52和YrC591连锁图谱的近着丝粒端,而Xgwm577、Xwmc273和Xcfa2040也位于YrZH84连锁图谱的近着丝粒端,只有Xbarc32位于该图谱的近端粒一侧(图5)。尽管分子标记之间的位置关系在不同的遗传群体和遗传背景下存在一些差异,但通过比较这4个抗条锈病基因的遗传连锁图谱,从共同的分子标记与这4个抗条锈病基因的位置关系推测,YrZM103可能是与Yr52、YrZH84和YrC591不同的抗条锈病基因。
5. YrZM103的来源
为探明郑麦103抗条锈病基因来源,利用本研究开发的分子标记检测了郑麦103的两个亲本周麦13和郑麦004。结果显示,从分子标记ZM229到WGGC13073的染色体区段郑麦103与周麦13相同,为抗病类型;郑麦103与郑麦004仅在分子标记ZM229和ZM221处相同(表2),推测郑麦103抗条锈病基因来源于周麦13的可能性大于郑麦004。由于没有鉴定另一亲本郑8904-7-1,因此无法准确判断郑麦103所含的抗条锈病基因是来源于周麦13还是郑8904-7-1。
表2 与YrZM103连锁的分子标记在郑麦103、周麦13和郑麦004上的扩增结果
基因型 |
ZM229 |
ZM221 |
ZM215 |
WGGC 13073 |
WGGC 7051 |
Xgwm577 |
Xwmc273 |
cfa2040 |
Xbarc32 |
郑麦103 |
A |
A |
A |
A |
A |
A |
A |
A |
A |
周麦13 |
A |
A |
A |
A |
B |
B |
B |
B |
B |
郑麦004 |
A |
A |
B |
B |
B |
B |
B |
B |
B |
A: 抗病带型; B: 感病带型
农大399/郑麦103杂交组合F2:3家系田间成株期条锈病抗性分离比率偏离理论上的显性单基因分离比率。部分染色体区段存在偏分离的位点,从而导致后代群体在该染色体区段的基因或性状存在偏分离。小麦7BL染色体上存在偏分离基因Sd2,本研究分离群体的条锈病抗性偏分离是否与Sd2有关还有待进一步研究。同时,BSR-Seq分析结果表明,2BS染色体和7BL染色体上均有最多的可能与抗条锈病基因相关的SNP位点。但经对2BS染色体上的8个SNP开发标记进行群体验证,发现这些亲本间存在的SNP与田间成株期条锈病抗性没有连锁关系。这可能与本研究田间成株期鉴定所用的条锈病菌为CYR32、CYR33和V26混合菌系有关,3个毒性不同的菌系可能对郑麦103中的抗条锈病基因具有一定的致病力差异,导致在条锈病抗性表型鉴定和抗性级别划分上存在一定的差异,后续的研究中将采用单一的条锈病菌系进行人工接种鉴定,以排除不同菌系致病性差异带来的影响。也可能在2BS染色体上存在微效的条锈病抗性QTL位点,对3个条锈病菌系中的个别菌系存在一定抗性,但对另外的菌系表现一定的感病性,在混合菌系接种情况下以及7BL条锈病抗性基因YrZM103的背景下难以表现出来,从而影响到抗病和感病混合池的构建和与其连锁的多态性SNP标记开发。
6. 结论
利用BSR-Seq将小麦品种郑麦103的抗条锈病基因YrZM103定位在7BL染色体末端18.7cM遗传区间,比较遗传学图谱表明YrZM103是与Yr52、YrZH84和YrC591不同的抗条锈病新基因。该研究为郑麦103的推广和育种利用以及抗条锈病基因的精细定位和分子标记辅助选择育种奠定了基础。
该研究完成于2015-2016年间,是我们实验室利用BSR-Seq技术进行抗病基因定位的系列论文之一。当时攻读学位的硕士研究生张怀志和博士生谢菁忠分别负责主要的实验和生物信息学分析,研究结果发表于作物学报杂志。
References
张怀志,谢菁忠,陈永兴等 (2017) 利用BSR-Seq定位小麦品种郑麦103抗条锈病基因YrZM103. 作物学报 43(11):1643-1649