Cell 高彩霞组综述基因编辑在作物改良的应用，全文翻译，值得收藏

2021年2月12日，Cell杂志在线发表了来自中国科学院遗传发育所高彩霞组发表题为“Genome engineering for crop improvement and future agriculture”的综述文章。该综述系统总结了CRISPR-Cas技术与现代育种方法的结合，将在作物改良计划中发挥重要作用。此外，还描述了植物基因组编辑的当前研究进展，重点介绍了使用这些技术可以产生的遗传修饰，以及将植物基因组编辑作为下一代植物育种技术用于作物改良的应用。

值得注意的是2020年11月6日，Nature Review Molecular Cell Biology杂志在线发表了来自中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组题为“Applications of CRISPR–Cas in agriculture and plant biotechnology”的综述文章。该文章首先重点介绍最新的精准基因编辑技术，例如碱基编辑和引导编辑系统。之后讨论了CRISPR–Cas系统在提高植物产量、品质、抗病性和抗除草剂及繁殖和加速驯化中的作用。最后重点介绍CRISPR-Cas相关联的植物生物技术的最新突破，包括CRISPR-Cas元件递送，基因调控，多重基因编辑和诱变以及定向进化技术Nat Rev（IF 55.4）高彩霞组综述CRISPR/Cas在农业和植物生物技术中的应用，值得收藏。

此外，2019年该课题组在Annual Review of Plant Biology杂志发表题为“CRISPR/Cas Genome Editing and Precision Plant Breeding in Agriculture”的综述文章。能够连续在三大权威顶尖综述杂志上发表关于基因编辑在农业育种中应用的综述文章，也从另一个方面说明了该课题组利用基因编辑在农业研究领域上处在世界领先水平。为此，我们简单的对Cell这篇综述进行全文的翻译，以飨读者！

养活不断增长的人口是一项重大挑战，尤其是在气候条件迅速变化的情况下。基因组编辑将彻底改变植物育种，并有助于确保全球粮食供应。该文将重点介绍新开发的技术，同时回顾植物中基因组编辑工具的开发和应用。并描述了基于基因组编辑的育种新植物的策略，并讨论了它们对农作物生产的影响，重点介绍了传统育种无法实现的基于基因组编辑的植物改良的最新进展。同时还讨论了基因组编辑面临的挑战，在实现该技术对未来作物和粮食生产的全部潜力之前，必须克服哪些挑战？

前言

到2050年，预计人口将达到100亿。我们这个时代的主要挑战是学习如何养活不断增长的人口并成功做到这一点。由于绿色革命和植物育种技术的进步，目前的农作物产量可以为大多数人口提供充足的粮食。然而，由于气候变化和耕地有限，农作物产量似乎处于停滞甚至下降的状态。要养活100亿全球人口，就需要将产量提高60％。因此，提高农业生产率和可持续性对整个世界至关重要。迫切需要作物生产中的科学突破和技术创新，以确保未来的全球粮食安全。

遗传变异是农业改良的基础。植物育种的目的是创造和利用这些遗传变异。在植物育种的悠久历史中，已使用了四种主要技术：杂交育种，突变育种，转基因育种和通过基因组编辑育种。传统的植物育种（杂交）涉及有针对性地杂交植物，以通过同源重组来结合理想的性状，在提高农业生产力方面发挥了重要作用。1950年代末开始的第一次绿色革命就是这种策略的例证，其中将“矮化”基因突变杂交到主要的主要农作物中，例如小麦（Triticum aestivum）和水稻（Oryza sativa），以获得高产品种。但是，由于杂交育种只能用来引入亲本基因组中已经存在的性状，因此优良种质的低遗传变异性限制了该技术的使用（图1）。在突变育种中，化学或辐射诱导的诱变被用于诱导全基因组范围内的随机突变，从而大大扩展了遗传变异。但是，从大量诱变植物中鉴定出具有所需性状的植株需要劳动密集型且耗时的（图1）。植物育种的关键突破是转基因育种的发展，其中将来自其他生物的基因或性状引入了农作物，从而提高了产量，减少了农药的使用并改善了营养。然而，到目前为止，由于这种技术将外来DNA随机整合到植物基因组中，因此只有少数转基因作物被利用，而这些转基因生物（GMO）受到严格的政府监管（图1）。另外，关于这些产品安全性的不良公众意见限制了它们的潜力。

已经开发了基因组编辑技术，可以将精确的和可预测的基因组修饰引入植物中以获得所需的性状，并且它们产生了定义下一代植物育种的精确育种技术（图1）。CRISPR-Cas已成为作物基因组工程的最先进系统之一。这项技术已迅速扩展，并已应用于主要作物，例如水稻，小麦和玉米，以及对粮食安全至关重要的其他作物，例如马铃薯和木薯。此外，最近开发的与CRISPR相关的工具（如碱基编辑器）极大地扩展了基因组编辑的范围，允许创建精确的核苷酸替换以及靶向的DNA缺失和插入。CRISPR-Cas技术与现代育种方法的结合，将在作物改良计划中发挥重要作用。在这篇综述中，将描述了植物基因组编辑的当前发展状态，重点介绍了使用这些技术可以产生的遗传修饰，以及将植物基因组编辑作为下一代植物育种技术用于作物改良的应用。

植物基因组编辑技术

植物基因组编辑是使用可编程序列特异性核酸酶（SSN）进行的。SSN包括锌指核酸酶（ZFN），转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）和CRISPR-Cas系统。这些核酸酶在靶位点形成DNA双链断裂（DSB），并通过DNA修复途径实现精确的基因组修饰。尽管大范围核酸酶，ZFN和TALENs通过蛋白质-DNA相互作用识别靶序列，但CRISPR-Cas系统通过Watson-Crick碱基配对靶向DNA序列，这取决于靶DNA与可编程“向导” RNA之间的同源性。由于其低成本，简单和高效，CRISPR-Cas系统已成为用于植物基因组编辑的最广泛使用的系统。在这里，介绍了一般的植物基因组编辑程序，并介绍了可以通过植物中的基因组编辑产生的许多遗传修饰。

 植物基因组编辑的一般程序

植物基因组编辑的一般过程可分为六个步骤：（1）根据靶序列选择合适的核酸酶；（2）构建基因组编辑载体；（3）使用原生质体（从酶消化的组织释放的无壁植物细胞；可选步骤）验证这些载体的活性；（4）将基因组编辑元件输送到植物细胞中；（5）通过组织培养将基因组编辑的细胞再生为小植株；（6）对所得的基因组编辑植物进行筛选和基因分型（图2A）。

尽管所有生物都使用相同的编辑工具，但传递和再生的某些方面特定于植物。基因组编辑元件有时可以直接转化为原生质体，但是在大多数情况下，它们是通过用基因枪或农杆菌以愈伤组织，胚胎或叶外植体的形式输送到植物细胞中的（图2B和2C） 。转化和再生步骤仍然是植物基因组编辑的瓶颈，因为必须针对每个物种和每个植物品种优化这些过程，这对于大多数优良品种和野生物种而言都是艰巨的任务。

基因组编辑元件的三种常见形式包括CRISPR-Cas9 DNA，RNA（Cas9的体外转录本和sgRNA）和RNP（核糖核蛋白，由Cas9蛋白和体外转录的sgRNA组成）。尽管可以通过粒子轰击和农杆菌介导的转化将DNA传递到植物细胞中，但只能通过粒子轰击将RNA和RNP传递到植物细胞中。当DNA被选择作为基因组编辑元件时，两种不同的策略可用于后续的组织培养过程：常规方法和瞬态DNA表达方法（图2C和2D）。在常规方法中，在组织培养过程中使用选择剂来选择抗性愈伤组织和转基因植物（图2B和2C）。一旦产生了转基因基因组编辑的突变体，就可以通过自交或杂交从突变体基因组中分离出基因组编辑载体，从而获得无转基因的突变植物（图2D）。在瞬时DNA表达方法中，在组织培养过程中不使用选择剂，从而无需分离过程即可产生不含转基因的突变体（图2C和2D）。可以使用RNA或RNP获得无外源DNA的基因组编辑。这些瞬时方法不会导致基因组整合事件进入植物基因组。因此，在随后的组织培养过程中不需要选择剂，并且通过瞬时表达CRISPR RNA（crRNA）或RNP创建的基因组编辑植物是无DNA突变体（图2C和2D）。无DNA基因组编辑优于常规方法，因为它不涉及外源DNA，并且可以大大减少植物中脱靶的编辑事件。

植物基因组编辑产生的遗传修饰

除了ZFN和TALEN，CRISPR-Cas系统的引入还促进了植物基因组编辑的发展。最广泛使用的CRISPR-Cas系统是Cas9和Cas12a复合物，它们都是执行核酸切割的单一效应蛋白（图3A）。最近，Cas12b系统也被开发用于植物基因组编辑。所有这些系统都依赖于crRNA来指导Cas蛋白靶向靶序列。Cas9蛋白需要一个额外的RNA分子，称为反式crRNA（tracrRNA），可以将其与相应的crRNA人工融合形成sgRNA。只需将DNA靶标原间隔序列设计为crRNA或sgRNA，即可对CRISPR-Cas系统进行编程。具有不同PAM（与原间隔物相邻的基序）特异性的各种Cas直系同源物和变体已得到鉴定和利用，以最大程度地提高这些工具的编辑范围。CRISPR-Cas系统和新开发的工具（例如碱基编辑器（图3B）和primer editing（图3C））极大地扩展了其潜在应用。迄今为止，基因组编辑已用于在植物中产生多种可遗传的基因组修饰，包括（1）小随机插入/缺失（indels）（图3D）；（2）点突变或核苷酸替代（图3E）；（3）DNA片段插入（图3F）；（4）DNA片段缺失（图3G）；（5）靶向染色体重排（图3H）。

经典的基因组编辑涉及靶基因座处DSB的修复。将SSN试剂递送到植物细胞中后，它们会识别并切割目标DNA并生成DSB，DSB可通过内源DNA修复途径进行修复，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源性定向修复（HDR）。NHEJ是用于修复DSB的主要途径，当NHEJ修复DSB时，可能在重新结合的染色体的交界处引入插入缺失。产生的插入缺失是随机的，其长度和序列是变化的，并且通常由于移码突变而导致基因敲除。此外，如果可获得或提供了同源DNA模板，则可以发生HDR。通过HDR介导的基因组编辑可以产生精确的基因替换，点突变以及DNA插入和缺失（图3A），但是HDR在植物细胞中的效率非常低。

除DSB介导的基因组编辑外，CRISPR-Cas衍生的碱基编辑器已成为生成可编程的单个DNA碱基改变的强大工具。碱基编辑器主要有两类：胞嘧啶基础编辑器（CBE）和腺嘌呤基础编辑器（ABE）。碱基编辑者是nCas9 D10A 核酸酶与单链DNA（ssDNA）特异性脱氨酶的融合体。这些脱氨酶，例如CBE中的rAPOBEC1和PmCDA1胞嘧啶脱氨酶或ABE中实验室演变的TadA脱氧腺苷脱氨酶，可催化CRISPR-Cas位于靶位点由R环诱导的R环的ssDNA链中的C⋅G转变为T⋅A或A⋅T转变为G⋅C （图3B和3E）。尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂在CBE中的融合可通过操纵内源性DNA修复机制来提高碱基编辑效率。CBE和ABE均已针对植物基因组进行了优化。使用脱氨基酶PmCDA1，hAID和hAPOBEC3A的其他CBE也已成功用于植物中。结合CBE和ABE的功能域的双碱基编辑器可以在同一目标位点同时诱导C⋅G到T⋅A和A⋅T到G⋅C的变化，从而进一步扩大了植物碱基编辑的范围。

当前的碱基编辑者仅限于碱基转换（从C⋅G到T⋅A，从A⋅T到G⋅C），但是无法产生DNA碱基转换和预定义的DNA插入和缺失。但是，最近的一项技术突破（即primer editing）允许在人类细胞中创建所有12种类型的碱基取代以及小的DNA插入和缺失（图3C）。primer 编辑器由两个部分组成：工程Cas9切口酶（H840A-逆转录酶（RT）融合蛋白和primer编辑指南RNA（pegRNA）。该pegRNA是具有3′-延伸的碱基的修饰的sgRNA，其包含引物结合位点（PBS）和编码所需编辑的RT模板。Cas9切口酶（H840A）识别靶位点并切口非靶DNA链，释放出与PBS配对的ssDNA，并用作RT的引物。通过逆转录，pegRNA上编码的编辑被转移到非靶DNA链上。随后通过DNA修复将新合成的经编辑的DNA襟翼并入靶位点。primer 编辑已迅速适应用于植物细胞，并且主要编辑的水稻和玉米植物已成功再生，尽管目前primer 编辑的编辑效率远低于植物基因组大多数目标位点的碱基编辑的效率。

已尝试通过使用其他RT，改变pegRNA中PBS和RT模板的长度，使用其他RT，用核酶处理pegRNA，提高培养温度以促进逆转录，使用增强的pegRNA启动子来提高引物编辑的效率表达，并富集转化细胞。通过基于解链温度设计pegRNA序列并使用双PegRNA，还提高了primer 编辑效率。此外，已经在水稻中开发了自动化的pegRNA设计平台（未发布的数据）。

DNA的精确插入使操纵基因功能和堆叠多种作物性状成为可能。HDR介导的DNA插入植物的效率相对较低（图3F）。或者当提供供体DNA模板时，可以利用NHEJ途径在DSB位点进行有效的DNA插入。一个成功的例子是通过NHEJ途径靶向内含子实现的CRISPR-Cas9介导的基因置换和插入（图3F）。为了增加NHEJ靶向插入的频率，将短的同源染色体片段添加到供体DNA的末端，以产生与DSB周围序列兼容的末端或微同源性。也可以用化学稳定的末端带有5′-磷酸化的双链寡脱氧核苷酸（dsODNs）供体刺激通过NHEJ的靶向插入。

靶DNA缺失对于编辑调节性和非编码DNA尤其重要，因为小插入缺失不太可能导致功能丧失。通过使用SSN诱导两个独立的DSB，可以获得靶向的DNA缺失（图3G）。例如，与一对sgRNA共表达Cas9可导致两个靶位点之间的区域> 100 kb缺失。此外，通过将Cas9或Cas12a与T5核酸外切酶融合或通过将SSN与核酸外切酶共表达，可以用单个gRNA产生靶向的缺失，但是这种缺失的长度受到限制。使用这些策略获得的缺失的DNA序列是无法预测或精确的，因为修复是通过NHEJ途径进行的。

可以通过微同源介导的末端连接（MMEJ）生成精确的DNA缺失，该连接使用微同源序列在DSB连接之前先对齐DSB的末端（图3G）。但是，这种策略只能在两个微同源序列之间产生缺失。新开发的APOBEC-Cas9融合诱导的缺失系统（AFID）可以产生多核苷酸缺失（图3G）。在这些系统中，Cas9在目标DNA序列处生成DSB，同时APOBEC将非目标链上的胞苷脱氨为尿苷，然后通过尿嘧啶DNA糖基化酶将其切除，从而生成无碱基（AP）位点。通过AP裂解酶去除AP位点导致可预测的和精确的缺失，其从脱氨基胞苷延伸到DSB。

当使用SSN诱导DSB时，也可实现可用于破坏或固定遗传连锁的靶向染色体重排（图3H）。当将成对的DSB同时引入同一条染色体时，两个断裂之间可能会产生缺失和倒位。这些重排主要归因于NHEJ流程，有时归因于MMEJ。最近显示，在玉米和拟南芥中可以实现以兆碱基对（Mbp）为目标的染色体反转。此外，后者证明了通过这种方法确实可以实现遗传交叉的恢复。当在不同染色体上生成两个或多个DSB时，也会触发染色体间重排，如交叉，易位和序列交换（图3H）。最近，利用CRISPR-Cas9系统在拟南芥中产生了异源染色体之间的相互易位。重要的是，这些易位在Mbp范围内并且是可遗传的。尽管如此，必须开发出更有效的工具来实现针对植物育种的目标染色体重排的巨大潜力。

涉及基因组编辑的下一代植物育种技术

传统的植物育种已经达到了养活不断增长的全球人口的极限。标记辅助选择和基因组辅助育种等技术进步正在进一步推动这一极限。基因组编辑为植物育种打开了一个新的工具包，该工具包将以前所未有的速度，高效且具有成本效益的方式进行，这将推动植物育种超越当前的极限，并进入下一代。

 定向诱变和精确育种

可编程的定向诱变促进了所需性状向作物的转移，并大大减少了广泛的遗传杂交和大规模后代基因分型的需要。BETAINE醛脱氢酶2（BADH2）的直接敲除可阻止2-乙酰基-1-吡咯啉（香米中的主要香精化合物）的生物合成，从而产生香米品种。乙酰乙酸合成酶（ALS）编码植物中支链氨基酸生物合成中的关键酶，并且是各种除草剂的目标蛋白，某些残基处的突变赋予除草剂耐受性。通过用CBE靶向OsALS的P171和/或G628密码子，产生了对ALS抑制性除草剂具有广谱耐受性的水稻植株，为水稻种植者提供了更好的杂草处理机会。基因组编辑对植物育种的主要贡献是消除了“有害”基因。例如，CRISPR-Cas9被成功用于敲除OsERF922（一种植物中真菌抗药性的负调节剂），从而产生了抗性水稻。由于某些“有害”负荷是多基因的，并且是由许多次要效应突变引起的，因此有效的多重基因组编辑将是去除所有有害等位基因的有前途的方法。

植物杂交的障碍禁止通过常规育种在物种间共享性状。有效的植物基因组编辑基于对基因组功能和基因组学的高级基础研究，因为支撑主要特征（例如开花时间，抗性，植物高度和种子大小）的分子机制通常在不同植物物种中均得到保留。可以使用基于模型植物研究获得的遗传和生物学信息的基因组编辑技术，直接改善各种作物物种的复杂性状（图4A）。因此，原则上，重要的性状可以在物种之间共享。通过编辑MILDEW RESISTANCE LOCUS（MLO）已经证明了这种跨物种性状“共享”，该基因是在大麦中首次发现的隐性基因，其失活导致对白粉病的持久，广谱抗性。通过编辑包括小麦，番茄（S. lycopersicum）和葡萄树（Vitis vinifera）在内的多种植物的MLO，已经获得了抗白粉病的能力。OsNP1和ZmIPE1编码假定的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶，是雄性不育所必需的。CRISPR-Cas9被用来编辑小麦中这些基因的直系同源基因（TaNP1），以实现完全的雄性不育。

当必须分离紧密连锁的基因座时，尤其是当一个基因座是有益的而另一种是有害的时，依靠基因重组的杂交育种就具有挑战性。打破这种遗传联系需要大量回交，这很费时，甚至在某些情况下甚至是不可能的。在这种情况下，可以两种方式使用编辑来改变有害等位基因。一种方法是诱导染色体重排以增加重组事件，因为SSN具有在植物中产生相互染色体易位和染色体内倒置的能力（图4A）。另一种方法是直接编辑或删除不需要的等位基因，从而绕过传统的基因渗入（图4A）。编辑已被用来通过敲除番茄中不希望的等位基因来打破连锁拖累，最近，在玉米中结合了两个紧密相连的遗传等位基因。小麦中一个新的RecQ解旋酶基因控制着全基因组的基因转换，并代表了一种内源的“连锁断裂机制”，该机制在DSB修复过程中将一个等位基因覆盖到另一个等位基因。通过基因组编辑利用相同的机制可以提供一种打破其他物种遗传联系的新方法。

多重基因组编辑和性状叠加

CRISPR与其他SSN相比的一个主要优点是它可以同时编辑多个目标位点。使用转移RNA处理，核酶自我切割，crRNA阵列或Csy4核糖核酸酶切割时，几个sgRNA可以在同一细胞中表达。多重基因编辑将大大加速重要特征的基因堆叠。为了进一步加快编辑和性状堆叠的周期，无需实验室的方法可以为与诸如快速育种技术之类的快速循环系统集成提供方便。

大约四分之一的维管植物是多倍体，其中许多植物在农业上具有重要意义，例如六倍体面包小麦，四倍体芸苔属植物，棉花和马铃薯。多倍体中的大多数基因以多份拷贝（同源物）存在，它们执行相同的功能以控制特定的植物性状。这些同源物必须同时突变以产生隐性变化。基因组编辑非常适合此目的（图4B）。这种方法首先在面包小麦中得到证实，在该小麦中同时编辑MLO的三个同等位基因赋予了对白粉病（一种主要的真菌病）的抗性。从那时起，基因组编辑已被部署来在其他多倍体作物中产生有价值的农艺性状。对于剂量依赖性表型很重要的基因剂量，也可以通过在多倍体作物中进行基因编辑来改变。

对16个完全测序的植物基因组的分析表明，可以将72％的蛋白质编码基因分类为旁系基因家族。基因家族的成员通常具有相似的结构和重叠的功能。这种功能冗余提供了遗传稳健性。因此，敲除一个旁系同源物可能是不够的，并且经常需要突变两个或多个旁系同源物以产生表型效应。多重编辑可用于此目的（图4B）。例如，小麦中的面筋基因家族包括编码至少29种α-麦醇溶蛋白，18种γ-麦醇溶蛋白和10种ω-麦醇溶蛋白以及16种低分子量和6种高分子量谷蛋白的基因。α-，γ-和ω-麦醇溶蛋白的免疫原性表位以及低分子量谷蛋白的免疫原性表位在1％–2％的人群中引发自身免疫性疾病乳糜泻。由于潜在的遗传复杂性，很难通过常规育种获得无麸质小麦。CRISPR-Cas9成功地用于同时编辑六倍体面包小麦中的多个α-和γ-麦醇溶蛋白基因。令人印象深刻的是，单次成功地突变了35个基因，免疫反应性降低了85％。一种更有效和精确的方法是使用碱基编辑器和primer 编辑器来特异性修饰免疫原性表位中的氨基酸。

编辑QTL

数量性状在农学上非常重要。这些性状是多基因的，并由数量性状基因座（QTL）控制，每个QTL在相互作用时直接对表型产生较小的影响。QTL并非以简单的孟德尔方式继承，因此极难研究和操作。调查植物中QTL的遗传变异的主要原因是为了改善作物。必须使用统计方法（例如QTL作图和全基因组关联研究（GWAS））而非常规遗传分析来鉴定QTL。依赖于可测量表型的QTL映射通常对主要QTL表现良好。基于深度测序的GWAS和泛基因组技术表明，大量的单核苷酸多态性（SNP）和结构变异（SV）与植物的数量性状变异有关。这些SNP和SV中的许多位于基因的非编码或调控区域，这使分子表征和确认变得复杂。基因组编辑通过提供将遗传多态性与表型差异联系起来的工具，显示出克服这些限制的巨大潜力（图4C）。QTL编辑可用于将多个所需的定量等位基因直接引入优良农作物品种，从而避免了密集杂交的需要。该技术将特别适用于在低重组区域编辑QTL。

CRISPR-Cas9被用来产生数百个靶向突变，以促进系统分析顺式调控区域与番茄表型变异的关系。基因组编辑还用于通过候选QTL的高通量编辑屏幕来识别QTL。使用CRISPR-Cas9和碱基编辑来编辑基因的上游开放阅读框（uORF）已被用于微调植物中目标蛋白质的表达水平，从而促进植物生产力，食品质量和对压力的适应之间的平衡。此外，CRISPR多重策略可用于修饰候选QTL或定义的QTL区域中所有基因的组合，从而导致可测量表型的改变。

从头驯化

几千年来，当今所有主要农作物都是从野生祖先驯养而来的。驯化丰富了提高作物生产力的性状，例如理想的植物结构，高产和易于收获；但是，随着时间的流逝，这会导致遗传瓶颈，从而导致遗传多样性下降和抗逆性下降。为了改良耕种的作物，自那时起就将野生近缘种的有益特性融入其中。不幸的是，这种杂交仅适用于单基因性状，并且野生物种中的许多有用性状，例如非生物胁迫耐受性，都是多基因的，并且在杂交和回交期间难以通过分离固定。通过基因组编辑从头驯化野生物种提供了一种有前途的替代育种策略（图4D）。作为概念的证明，成功进行了驯化基因的多重编辑，以部分驯化野生番茄（S.pimpinellifolium），同时保留了对野生菌株的胁迫耐受性。野生稻的驯化也是一个有吸引力的目标。同种四倍体野生稻物种Oryza alta具有很大的生物量，能够抵抗生物和非生物胁迫，使其成为未来的有希望的作物。最近已经确定了一种理想的O.alta生态型并使用CRISPR创建了具有改良农业性状的突变品系。这些研究为加快野生植物物种的驯化奠定了基础。

从头驯化还具有提高孤儿作物产量和营养含量以满足当地需求的巨大潜力。这些野生农作物的单产远低于耕作农作物，但它们能抵抗环境压力，可以在边缘土地上种植，表明与西红柿密切相关的一种孤儿作物地面樱桃可以得到快速改良。通过加速驯化。其他孤儿作物，例如高粱，Setaria viridis，Vigna unguiculata，Chenopodium quinoa，木薯和Eragrostis tef，都是从头驯化的良好原料。除经典育种和其他技术外，完全驯化的新栽培农作物的创造可能还需要进行反复的编辑活动。利用从头驯化将孤儿作物转化为新的超级作物可能是确保全球粮食供应的有效途径。值得回顾的是，在18世纪和19世纪，向欧洲引入了一种新的主食，即马铃薯，在欧洲人口增长和城市化进程中发挥了关键作用。

单倍体诱导和人工无融合生殖

传统植物育种需要六到七代自花授粉才能提供高度纯合，稳定的品种。双倍单倍体的产生可有效地在两代内固定重组单倍体基因组，从而与传统的冗长繁殖程序相比，极大地加快了繁殖过程并降低了成本。内源植物基因的直接编辑是产生单倍体诱导物系的有效方法。编码精子细胞特异性磷脂酶的MTL / PLA1 / NLD的敲除导致在玉米，水稻和小麦中产生有缺陷的雄配子体和母本单倍体诱导表型。通过经由CRISPR介导的诱变操作DMP在玉米中获得了相似的结果（图4E）。

CRISPR-Cas9介导的CENH3 N末端α-螺旋的缺失导致拟南芥中产生单倍体诱导物系。TaCENH3α基因在小麦中的基因组编辑导致单倍体诱导率为约7％；编辑杂合基因型的恢复的移码等位基因比纯合体组合触发更高的父本单倍体诱导率。重要的是，通过单倍体诱导编辑（HI-Edit）和单倍体诱导物介导的基因组编辑（IMGE）成功地修饰了几种转化困难作物品种。HI-Edit / IMGE使直接的基因组修饰进入任何优良商业品种背景中，并在载有针对所需农艺性状的CRISPR-Cas盒的单倍体诱导系授粉时产生无转基因的农作物。

开花植物（被子植物）的种子发育是由双重受精触发的，其中单倍体卵细胞和二倍体中央细胞各自与精子细胞融合，产生二倍体胚胎和三倍体胚乳。在某些物种中，种子可以通过无融合生殖的过程进行无性繁殖。该过程导致产生遗传上相同的种子，这些种子在植物育种中具有许多应用。无融合生殖自然存在于> 400个物种中。但是，此过程在大多数主要农作物中都不会发生，并且很难通过常规育种进行工程改造。无融合生殖需要三个主要步骤：形成未减少的雌配子体（无核生殖），从配子体中胚胎发育而不使卵细胞受精（孤雌生殖）和胚乳受精。在水稻中可以通过CRISPR-Cas9敲除减数分裂基因REC8，PAIR1和OSD1来诱导无融合生殖或“有丝分裂代替减数分裂”（MiMe）（图4E）。创建无融合生殖植物的一种方法是消除基因组。证明Cas9诱导的水稻MATRILINEAL（MTL）的敲除导致单倍体诱导，同时编辑OSD1，PAIR1，REC8和MTL产生了产生克隆种子的植物。另一种方法是在不受精的情况下触发雌性配子的胚胎发育（图4E）。未受精卵细胞中BBM1的错误表达触发了水稻的胚发生。将此过程与通过编辑生成的MiMe突变相结合，产生合成无融合生殖。由于在这两种方法中使用的基因在其他植物中都是保守的，因此这些方法应适用于其他主要农作物。尽管水稻中的无性系种子取得了成功，但在实现合成无融合生殖在现代农业中的实际应用之前，例如朝着固定杂种优势的方向发展之前，还需要进行更多的改进。操纵胚乳受精可以促进农作物合成无融合生殖的产生。

大规模筛选特征发现

为了将基因组编辑应用于植物育种，必须了解有益性状的遗传调控。CRISPR-Cas9筛选可用作基因组和表型之间的全基因组表征的正向遗传筛选工具。对于这种类型的筛选，Cas9与靶向植物中许多或所有基因的sgRNA文库一起表达。植物转化后，再生编辑过的植物，并筛选其子代以寻找感兴趣的性状。通过对富集变异体的sgRNA进行测序，可以确定目标基因或突变体。CRISPR-Cas9已成功用于水稻的全基因组筛选，并在番茄，大豆（Glycine max）和玉米中产生突变种群（图4F）。这种方法比化学，物理或转座子诱变更有效地在植物中产生全基因组突变。然而，当前植物中的CRISPR筛选需要费力的植物组织培养程序。将来，利用强大的表型读数和单细胞测序技术的单细胞或基于原生质体的筛选方法可能会加快性状发现的速度。

CRISPR-Cas大规模筛选的另一个重要应用涉及在基因或其功能域中引入饱和突变，然后进行定向进化筛选以进行性状工程和新性状发现（图4F）。这种方法需要使用sgRNA文库生产各种突变体，以及用于筛选和选择具有所需特性的植物的有效方法。通过将Cas9与sgRNA文库偶联，直至相关编码序列的两条链上的所有潜在位点，CRISPR-Cas9已成功用于天然植物环境中的定向蛋白质进化。然而，Cas9诱导的主要突变是与插入缺失相关的移码，这使得难以产生产生SNP所需的所有氨基酸替代，SNP是自然界中最常见的遗传变异来源。基本编辑器是解决此难题的理想工具。例如，将sgRNA文库与CBE或ABE一起传递到植物细胞中，以通过在水稻中产生OsACC的功能变体来促进除草剂抗性的进化。此外，开发了双胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，可同时生成从C⋅G到T⋅A和A⋅T到G⋅C的转换，并已用于选定OsACC靶标结构域的近饱和诱变。在这些CRISPR指导的进化活动中回收了已知和新颖的变体。但是，只能以这种方式工程化有限数量的植物蛋白。使用单细胞或原生质体进行迭代突变和选择的方法将来可能会扩展该方法的实用性。

挑战与未来展望

 提高精确的基因组编辑效率

尽管植物基因组编辑方面有最新的技术进步，但仍然不可能在基因组中生成所有所需的更改。迫切需要精确的基因组编辑，例如产生目标碱基的替换，基因插入/缺失和基因替换，以改良农作物的性状。原则上，HDR介导的基因组编辑可用于精确地重写任何基因组并产生指定的编辑。已经使用各种策略来提高植物细胞中的HDR效率，例如使用双生病毒构建体，植物体内基因靶向（GT）系统或化学修饰来稳定供体模板。通过使供体DNA模板靠近DSB，操纵DNA修复途径，利用特定的细胞周期阶段和细胞类型或使用不同的SSN，也可以提高HDR效率。尽管已经基于上述策略在许多植物中报道了精确的HDR介导的基因组编辑，但是该过程本身在体植物细胞中仍然效率极低。

为了克服这些限制，新开发的DNA碱基编辑系统（CBE和ABE）提供了有效且简单的方法，可以将特定的DNA碱基转换为目标基因组位点的另一个碱基。但是，目前仅限于将C⋅G替换为T⋅A，将A⋅T替换为G⋅C。因此，必须通过工程脱氨酶，操纵DNA修复途径或蛋白质工程来开发其他基础编辑系统，例如C⋅G至G⋅C。除碱基编辑外，primer 编辑可用于生成任何碱基替换，但是目前它们显示出相当低的编辑效率。由于primer 编辑器的活性取决于许多因素，例如RT的活性，pegRNA中PBS的长度和RT模板，因此需要更多的策略来改善植物细胞中主要编辑者的活性。尽管最初的编辑不能产生大量的基因插入，但最近发现的与CRISPR相关的转座酶可以高效地将DNA整合到细菌基因组中，这为将来将大量DNA插入植物基因组打开了大门。

改善基因组编辑的特异性

脱靶效应是基因组编辑中的主要问题之一。CRISPR技术产生两种类型的脱靶编辑：依赖sgRNA和不依赖sgRNA的脱靶编辑。依赖sgRNA的脱靶编辑是通过编辑脱靶位点诱导的，这些位点与靶上sgRNA序列不匹配。全基因组测序表明，CRISPR-Cas系统不会在水稻或棉花中诱导不依赖sgRNA的脱靶效应。但是，一些CBE诱导水稻中不依赖全基因组的sgRNA脱靶突变，这是由全基因组ssDNA区域中的胞苷脱氨酶活性触发的。与将许多意外突变引入植物基因组的常规突变育种相比，植物基因组编辑具有很高的特异性。此外，可以通过回交消除有限数量的脱靶突变。可以通过瞬时表达编辑试剂来增强CRISPR-Cas的特异性，如在小麦和玉米中证明的那样，可以通过使用合理设计的指导RNA或通过使用工程改造的Cas9，Cas12a和脱氨基酶的精确变体来增强。但是，需要进一步研究来解决脱靶编辑的倾向，尤其是在开发更灵敏的方法以检测植物中全基因组脱靶突变以及鉴定具有更高特异性的改良或新编辑器方面。我相信随着技术的进步，植物基因组编辑的脱靶效应将不再是问题。

 优化植物细胞的输送和再生系统

理想的植物基因组编辑试剂输送系统是不依赖基因型，无组织培养的，并且直接应用于特定组织，例如分生组织，叶片，种子或下胚轴。当前的递送方法包括粒子轰击，土壤杆菌介导的转化，聚乙二醇（PEG），病毒载体和纳米颗粒。最近显示，sgRNA和RNA病毒表达的内源性可移动RNA序列的融合会迁移到分生组织区域并产生可遗传的突变。纳米颗粒和其他新材料可能会成为编辑试剂的有用工具。例如，碳纳米管可用于将DNA传递到植物叶片中，从而成功表达蛋白质。如果该系统可以将基因组编辑试剂传递到茎尖分生组织中，则可以实现无组织培养的编辑。

一旦基因组编辑试剂被递送到体细胞中，则需要随后的组织培养和植物再生以获得被编辑的植物；但是，此再生步骤在大多数农作物中极具挑战性。植物的再生是基于体细胞的全能性，它使植物细胞与大多数其他真核细胞区分开。促进体细胞胚发生的发育调节剂（指定的促进剂）已用于促进植物再生（图2B和2C）。过表达两种发育调节因子，WUSCHEL（WUS）和BABY BOOM（BBM），可提高各种转化难治性基因型和物种的再生频率。尽管WUS和BBM的稳定转化会引起玉米的形态缺陷和不育，但使用合适的启动子控制WUS和BBM的组织和时间特异性表达可减轻其多效性作用。生长调节因子（GRF），GRF相互作用因子（GIF）和GRF-GIF嵌合体也已用于提高各种单子叶植物和双子叶植物的再生效率。与WUS和BBM相比，GRF，GIF和GRF-GIF嵌合体在组成型表达时没有明显的副作用，绕过了转化后但再生之前切离它们的费力且费时的步骤。发育调节剂也可用于通过从头分生组织诱导产生基因组编辑的双子叶植物，这回避了组织培养的需要。尽管有这些有前途的技术，植物遗传转化和再生仍然需要使用专门的设备，因此有必要简化这两个过程以在大多数实验室中进行常规植物基因组编辑。

植物合成生物学

合成生物学是用于加速新型农艺性状发展的新策略。CRISPR-Cas系统具有改善植物设计和合成生物学的巨大潜力（图4G）。通过编辑内源基因或引入编码各种酶或信号传导途径成分的外源基因，研究人员已经能够重定向固有的代谢网络或在植物中建立新的途径，以生产富含所需天然或人工化合物的食物（图4G）。CRISPR-Cas介导的多重基因编辑和调控可用于完成这项合成生物学任务。例如，植物中的光合作用系统远非完美，因为在光合作用途径中发挥作用的核心酶Rubisco对CO2的固定效率很低，并且由于光呼吸而中毒，从而导致大量的碳，氮和能量损失。通过引入人工旁路光呼吸的成分或通过CRISPR介导的DNA插入重新设计Rubisco，可以提高植物的光合作用效率和生物量。除了这些前景外，基因组编辑还可以促进植物合成生物学的其他方面，例如建立用于监测细胞内信号的植物生物传感器或用于检测环境刺激的植物生物记录仪。

 植物微生物组工程

在自然界中，植物暴露于数万亿微生物，包括细菌，真菌，原生动物，古细菌和病毒。有益的植物-微生物组相互作用可以改善植物生长或控制病原体。在一组促进植物生长的根际细菌中接种微生物群可以增强植物的发育，并有助于保护植物免受病原体和非生物胁迫的侵害。因此，微生物组被认为代表了植物中的“第二基因组”。植物微生物组通过改变营养吸收和基因表达以及充当生物防治病原体来影响植物的生长。微生物组工程已经对农业生产产生了重大影响。高通量测序和CRISPR介导的基因组编辑的最新进展为细菌基因在微生物群落中的作用提供了见识，而这些修饰微生物组的新方法可能会改善未来的作物生长和病原体抗性（图4H）。

CRISPR系统可用于精确编辑复杂微生物群落中特定生物的基因组。然后可以将这些经过编辑的生物返回实验室环境，以研究特定的修饰是否会在宿主植物中导致新的特性，例如改善的营养吸收或病原体抗性。这样的信息将揭示微生物群落中特定生物的确切功能。CRISPR系统可以首先转化为微生物群落，然后递送至天然植物生长环境，例如土壤和叶片。CRISPR系统还可以通过相互作用和结合从修饰的微生物转移到其他微生物群落成员，从而导致植物微生物组的原位基因组编辑（图4H）。植物微生物组的这种精确的基因组编辑将为改善作物产量提供新的方法。

为基因组编辑作物的基于科学的监管框架做出贡献

基因组编辑植物的监管和社会认可对于开发新育种技术及其衍生作物和产品至关重要，但是这些步骤仍然存在问题。当前，当调节基因组编辑的作物时，采用基于过程或基于产品的调节方法。欧盟使用基于过程的法规，而加拿大，美国和阿根廷则支持基于产品的方法，但是大多数其他国家尚未建立其监管框架。迄今为止，已经使用基于产品的方法完全批准了几家经过编辑的工厂。目前等待监管部门批准的大多数基因组编辑植物均已由公共研究机构和中小型公司提交。但是，如果采用限制性监管方法并将经过编辑的工厂视为转基因生物，则会造成巨大的财务负担，只有大型跨国公司才能承受。对于无转基因的编辑产品，法规必须合理且易于浏览。已经提出了针对基因组编辑作物的基于科学的管理框架。由于基因组编辑不是一种单一的技术，而是一种分子工具箱，因此可能不适合使用一种全面的，一刀切的监管方法。相反，应该使用分层的监管系统来容纳现有技术和未来技术。需要付出更多的努力来确保监管透明性并打开对话。公共传播应基于事实和科学。我们应该打开对话并以不同的声音参与其中，包括最需要增加粮食产量的发展中国家和不发达国家的声音。尽管如此，和解不同利益相关者的利益冲突必将带来重大挑战

 结论

植物基因组编辑技术的发展为植物育种提供了广泛的机会。通过基因组编辑进行高效，精确和有针对性的诱变，为许多下一代育种策略奠定了基础，这些策略将彻底改变农业的未来。为了充分利用植物基因组编辑的潜力，必须探索所有方法。基因组编辑允许合理地将遗传性状的组合设计到作物中。这些精确有效的技术用于快速植物育种时，其结果类似于经典育种。但是，基于基因组编辑的下一代育种不可能完全取代传统方法。只有结合其他技术，例如高通量表型，基因组选择和快速育种，我们才能保证基因组编辑在农业中的广泛实施。这种多学科的方法将促进植物育种，以帮助实现第二次绿色革命，从而满足在不断变化的气候条件下快速增长的全球人口不断增长的粮食需求。

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