CRISPR/Cas9技术在HT-29细胞中的应用

CRISPR/Cas9技术是一种高度特异性的基因编辑方法，可以在细胞或个体层面引发基因序列的缺失、序列插入和定点突变等，使用催化活性失活的dCas9可以阻断转录进而抑制基因表达。 CRISPR/Cas9技术在HT-29细胞中也有广泛的应用，比如研究发现在HT-29细胞和原发人结肠癌细胞中通过shRNA诱导周期蛋白依赖性激酶(CDK)样激酶p38γ沉默或CRISPR/ cas9介导的p38γ敲除，都能抑制细胞的生长、增殖和迁移，并显著诱导细胞的凋亡^[7]。

下面具体介绍一个利用CRISPR研究直肠癌细胞耐药机制的案例^[8]，便于大家开拓思路。药物治疗是结直肠癌患者治疗的一种方式，但是持续用药会造成结直肠癌细胞耐药。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种人工合成的核苷酸类似物，自20世纪50年代以来一直作为CRC患者化疗的主要药物，主要通过抑制胸苷酸合酶并将其代谢产物掺入DNA，从而导致细胞死亡。 此外，oxaliplatin也可用于结直肠癌患者的药物治疗，该药物属于第三代铂类药物，能够形成铂- DNA复合物引发细胞毒性。

Jinming Yu等人分别利用5-FU和oxaliplatin长时间处理的方式建立了HT-29和SW480耐药细胞株。通过Western blot实验发现REV7(转译合成聚合酶ζ(POLζ)的关键组成部分)在5-FU和oxaliplatin耐药的CRC细胞中均上调（Fig 1. a-d），且在随着药物处理浓度的增加，HT-29和SW480中的REV7也呈现递增的趋势，表现出剂量依赖性（Fig 1. e-h）。但有趣的是，药物处理后，REV7 mRNA的表达没有显著的差异，也就意味着REV7蛋白的增加不是转录水平的变化引起的。

Fig 1.

随后，Jinming Yu等人利用CRISPR/Cas9技术特异靶向REV7基因，发现在药物处理条件下，REV7在REV7缺失细胞株中几乎不表达（Fig 2. a-b）。plasmid-based TLS efficiency分析发现REV7缺失显著抑制了耐药HT29细胞中的TLS（translesion synthesis）效率，而在补充REV7后，这一现象又会得到缓解（Fig 2. c-d）。

Fig 2.

在小鼠异种移植耐药细胞株模型实验中发现，当没有药物刺激的情况下，REV7的表达不影响肿瘤体积，说明REV7不影响结直肠癌的发生。当给予药物刺激时，REV7的缺失会明显抑制肿瘤生长，但在个体重量方面并没有显著差异（Fig 3.）。

Fig 3.