【干货】基因敲除细胞系的敲除策略

 如果选择的方法不对，或者细胞不对

将不可避免的要全部基因敲除细胞的工作推翻重来，下面我们来看看影响基因敲除细胞系的要点有哪些吧？搞清楚具体的流程和步骤，轻松搞定基因敲除细胞系。

一，做基因敲除的细胞如何选？
1.  最重要的就是：不能有支原体污染，这个东西在绝大部分的实验室都不太重视，所以导致这个问题非常严重！如果支原体污染的细胞会导致细胞的增殖问题，同时还会影响细胞的代谢，出来的数据也是很奇怪的。
检测方法：PCR法或者是培养法；
2.  基因敲除的细胞特点有：细胞容易增殖，克隆形成率高，没有多基因的问题，染色体不要突变太严重；不增殖的细胞，就算是做了细胞基因敲除，也无法获得基因敲除的单克隆，细胞极其有限；如果克隆的拷贝数太多，做基因敲除是非常难以获得纯合敲除的细胞系的，具体原因就是：如果敲除效率是x，那拷贝数是n，那纯合敲除的效率就是：Xn，具体可见有多低了！
3.  做基因敲除的细胞系:  最好是肿瘤细胞系，不要是永生细胞系，很多永生细胞系往往都做起来挺困难；

二、基因敲除细胞系的敲除策略？
1.  优选做片段敲除:  片段敲除，片段敲除！重要的事情说3遍，其实很简单，如果做移码敲除，一个细胞里面有2个基因位点，是非常困难保证两个位点都一样的移码，所以就会有不同的移码的数据，所以鉴定的时候测序看图的时候非常麻烦！而且最重要是：移码很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题！！！神秘的条带，可以让你很头疼。（很多平台会告诉你，那个不是你要的条带，不要管他就好。骗谁呢？文章还怎么发？）所以，选择片段敲除是一个最为保险的办法：大片段几kb的缺失，mRNA就没有目的蛋白的转录，Western Blot那才叫放心。Cas9X平台一直坚持为客户做片段敲除的细胞服务。

2.  容易鉴定敲除策略：基因敲除细胞系，如果是片段敲除，很容易通过对目的片段的PCR扩增的方式，判断是否为纯合敲除细胞系；这个不知道要甩移码敲除多少条街了。PCR鉴定有多方便？再想想测序和读图谱的有多累。

3.  基因敲除细胞系的扩增：Cas9X不仅仅提供敲除，还提供扩增，很多细胞都不好扩增，我们可以依据需要扩增到客户需要的敲除细胞量。

4.  MixClone技术：性价比超高的基因敲除细胞系服务；（Cell Pool）

5.  ClonePlus技术：再困难的细胞，我们也可以做到基因敲除纯合克隆交付。

三、周期分析？
1.  如果用病毒法，构建载体，包病毒:  转染细胞，筛选，单克隆，PCR鉴定/测序,扩增——这个流程一个步骤都少不了，肯定做到你怀疑人生；
2.  用Cas9X特色的瞬时电转技术： 超过表达量的Cas9蛋白+gRNA，快速靶向，最快只需要5周时间，7-12周就可以拿到纯合子细胞；
3.  所以选择细胞也不要选择增殖太慢的:  否则做基因敲除细胞系，则是一个要有耐心的工作。

四、拿到细胞怎样用？
1.  如果需要大量扩增：Cas9X还可以赠送细胞培养基，培养起来更方便；同时是单克隆的细胞，完全不用担心培养过程中蛋白回复的问题，如果是移码突变，大量扩增试试看，如果两个拷贝移码序列不一致，很快就出现回复突变，蛋白又回来了（特别是敲除的蛋白对细胞增殖有优势的）
2.  细胞回输和代谢实验更放心：Cas9X提供的所有的细胞都经过严格测试，保证安全无污染，低内毒素可以直接用于动物实验；做代谢分析也能更加安心。

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