纯化腺病毒载体构建流程

腺病毒是一种非常有效的转基因载体，可插入至37Kb的外源基因，高效的转导效率，可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限制，容易得到高低度，进入细胞内而不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。由于以上在临床上得到广泛的应用。

为了提高腺病毒载体的基因容量，安全性，科学家利用基因工程技术，不断地对腺病毒载体急性改造。第一代腺病毒载体是将E1和E3基因剔除，提高了其免疫原性，可以插入4.5Kb的外源基因。第二代腺病毒载体，剔除了E2/E4基因，载体容量得到了提高，但是与第一代比较，免疫反应比较弱，产量比较低，滴度降低。第三代腺病毒载体也称为辅助病毒载体（helper-dependent vector）或无病毒载体（gutless vector）,指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅保留了ITR和包装信号序列。外源基因容量大幅度提高，可达37Kb，由于无病毒蛋白表达，降低了免疫反应，安全性得到了大幅提高。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。

大规模腺病毒下游纯化面临着巨大的挑战：一个完整的腺病毒颗粒，包含2700多种蛋白亚基，分子量达165MDa，分子大小约为0.1um。这些复杂的颗粒很容易产生成千上万钟的电荷异构体，给下游纯化带来巨大的压力，增加了纯化的复杂性。

Bio-Rad经过多种填料的筛选，优化工艺，最后采用两步层析，可以有效去除宿主蛋白,核酸等杂质，获得高活性的，高纯度，浓缩腺病毒，质量达到了临床应用的级别。该工艺简单,步骤之间易于衔接,非常适合产业化放大。

工艺总结：1利用Nuiva cPrime混合机制填料高分辨率，洗脱温和的特点，快速捕获和浓缩腺病毒载体；2利用Nuvia Q可以耐受一定高盐，而且高盐浓度下可以增加腺病毒载量，减少填料用量；3该工艺各步骤之间衔接良好，无需更换缓冲液，仅需要稀释和微调pH即可上样，工艺放大简单；4工艺回收率达到54%，DNA低于检测限，HCP低于2ng/1010 particles, 满足临床需要。

参考文献：

Bulletin_6719 Development of an efficientmanufacturing process for adenovirus