炮制时长对何首乌质量控制的影响

何首乌是一种常用的中药材， 又称赤首乌、 首乌、 乌肝石、 地精等， 属蓼科植物何首乌 Polygonum multi- florum Thunb． 的干燥根茎 ［1 ］ 。我国何首乌野生品主要 分布于中南、 西南、 华东地区。何首乌生品具有消痈、解毒、 润肠通便的作用， 用于风疹瘙痒、 瘰疬疮痈、 肠燥 便秘的治疗;制首乌为何首乌炮制品， 具有补肝肾、 乌 须发、 益精血、 化浊降脂、 强筋骨等功效， 主要用于治疗 眩晕耳鸣、 血虚萎黄、 腰膝酸软、 须发早白、 崩漏带下等 症 ［2 －3 ］ 。何首乌是一种典型的生熟异治中药， 其药效 的发挥很大程度上取决于炮制工艺。为了完善制何首 乌质量评价标准， 本文探讨不同炮制时间对制何首乌 中 9 种主要有效成分的影响， 现报道如下。

1 材料

1. 1 仪器

电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司);可调式 移液器(北京大龙生物仪器有限公司);低速自动平衡 离心机(北京雷勃尔仪器有限公司);紫外分光光度计 (北京瑞利仪器有限公司);1260 HPLC 色谱分析仪 (Agilent);ZOＲBAX C 18 柱色谱柱(Agilent， 250 mm × 4. 6 mm， 5 μm)。

1. 2 试药

同一批次(批号:150608)生何首乌药材购自河北 安国美威药材公司， 经鉴定为蓼科植物何首乌的干燥 根茎;大黄素、 大黄素甲醚、 大黄酚 －8 － O － β － D － 葡 萄吡喃糖苷、 2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯 － 2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 儿茶素、 没食子酸、 没食子酸酯、 苜蓿素和何首乌乙素。购自中国食品药品检定研究 院， 纯度均≥99% 。

1. 3 试剂

分析纯无水乙醇、 甲醇等试剂均为中华试剂网产 品;色谱级甲酸、 乙腈均为德国默克公司产品。

2 方法

2. 1 供试品溶液的制备

依据 2015 版《中华人民共和国药典》 ， 取黑豆 1 kg， 加水适量， 煮约 4 h， 熬汁约 1. 5 kg， 豆渣再加水煮 约 3 h， 熬汁约 1 kg， 合并得黑豆汁约 2. 5 kg。取何首 乌片或块 10 kg， 加上述黑豆汁拌匀， 照炖法分别于 2 h、 4 h、 6 h、 8 h、 10 h、 12 h、 14 h、 16 h 取样适量， 置非铁 质的适宜容器内， 炖至汁液吸尽， 干燥。平行 3 份。精 密称取各粗粉 0. 2 g， 置具塞三角瓶中， 加 50 mL 50% 乙醇， 加热回流 30 min， 0. 45 μm 微孔滤膜滤过， 取续 滤液进样。

2. 2 对照品溶液的制备

精密称取大黄素、 大黄素甲醚、 大黄酚 －8 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯 － 2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 儿茶素、 没食子酸、 没食 子酸酯、 苜蓿素和何首乌乙素标准品于10 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 配置成质量浓度分别为 65、 120、 86、 78、 35、 96、 132、 108 和 92 μg/L 的对照品溶液。

2. 3 方法学考察

2. 3. 1 色谱条件 依据《中华人民共和国药典》 2015 年版一部附录Ⅵ， 采用 HPLC 检测， 色谱条件为:色谱 柱:Agilent ZOBAX C 18 柱(250 mm ×4. 6 mm， 5 μm);进 样量:10 μL;流动相:乙腈和 0. 1%甲酸溶液;梯度洗脱: 0 ～5 min， 8% 乙腈;5 ～ 30 min， 8% ～ 20% 乙腈;30 ～ 35 min， 20% ～32% 乙腈， 35 ～ 46 min， 32% ～ 43% 乙腈;46 ～58 min， 43% ～52%， 58 ～70 min， 52% ～70% 乙腈;柱 温:35 ℃;流速:1. 0 mL/min;检测波长:270 nm。

2. 3. 2 线性 精密吸取质量浓度为对照品溶液于 10 mL 量瓶中， 甲醇梯度稀释， 得到一系列浓度的标准溶 液， 按上述色谱条件注入色谱仪， 以进样量为横坐标， 峰面积为纵坐标进行线性回归。

2. 3. 3 精密度试验 取供试品溶液， 按上述的色谱条 件连续进样 6 次， 计算各化合物峰面积 ＲSD。

2. 3. 4 稳定性试验 取供试品溶液， 分别在 0 h、 2 h、 4 h、 8 h 和 10 h， 按上述的色谱条件连续进样 6 次， 计 算各化合物峰面积 ＲSD。

2. 3. 5 重复性试验 取何首乌药材 6 份， 按 2. 1 项下 方法平行制取供试品溶液并测定， 计算各化合物峰面 积 ＲSD。

2. 3. 6 回收率试验 取何首乌药材 3 份， 分别精密加 入 9 种对照品适量， 按 2. 1 项下方法平行制取供试品 溶液并测定， 计算各化合物回收率。

2. 4 含量测定

取 2. 1 项下的生何首乌以和 8 个不同炮制时间的 制首乌样品进行含量测定， 以峰面积代入标准曲线方 程进行计算， 得到各有效成分含量。平行 3 份。

2. 5 统计分析

统计分析所有资料采用 SPSS 18. 0 进行各个炮制 时间样品进行系统聚类分析。以 P ＜ 0. 05 为差异有 统计学意义。

3 结果

3. 1 线性

表 1 结果表明大黄素、 大黄素甲醚、 大黄酚 － 8 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙 烯 －2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 儿茶素、 没食子酸、 没食子酸酯、 苜蓿素和何首乌乙素线性关系良好。

表 1 首乌 9 种有效成分 HPLC 方法学考察线性结果

化合物 线性方程
大黄素 Y =0. 935X －0. 315(r =0. 9991)
大黄素甲醚 Y =1. 025X +0. 516(r =0. 9992)
大黄酚 －8 － O － β － D －
葡萄吡喃糖苷
Y =0. 953X +0. 439(r =0. 9995)
2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯
－2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷
Y =1. 357X －0. 657(r =0. 9993)
儿茶素 Y =0. 759X +0. 436(r =0. 9992)
没食子酸 Y =0. 852X －0. 356(r =0. 9992)
没食子酸酯 Y =1. 275X +0. 176(r =0. 9997)
苜蓿素 Y =0. 751X －0. 263(r =0. 9991)
何首乌乙素 Y =1. 635X －0. 935(r =0. 9998)

3. 2 精密度试验、 稳定性试验和重复性试验

精密度试验、 稳定性试验和重复性试验结果显示， 大黄素、 大黄素甲醚、 大黄酚 － 8 － O － β － D － 葡萄吡 喃糖苷、 2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯 －2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 儿茶素、 没食子酸、 没食子酸酯、 苜蓿素 和何首乌乙素 ＲSD 均在 5% 以下， 表明以其精密度良 好， 样品稳定， 方法具有很好的重复性。见表 2。

3. 3 回收率试验

大黄素、 大黄素甲醚、 大黄酚 － 8 － O － β － D － 葡 萄吡喃糖苷、 2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯 － 2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷、 儿茶素、 没食子酸、 没食子酸酯、 苜蓿素和何首乌乙素回收率在 95% ～ 105% 区间内， 符合 《中华人民共和国药典》 标准。见表 3。

表 2 首乌 9 种有效成分 HPLC 方法学考察精密度试验、 稳定性试验和重复性试验结果

化合物 精密度 试验 稳定性 试验 重复性 试验
大黄素 3. 80 1. 46 3. 40
大黄素甲醚 2. 69 4. 04 2. 34
大黄酚 －8 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷 3. 87 3. 79 2. 04
2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯
－2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷
3. 17 3. 52 3. 15
儿茶素 3. 46 1. 84 1. 34
没食子酸 1. 41 3. 34 1. 89
没食子酸酯 3. 87 3. 36 2. 83
苜蓿素 2. 55 3. 70 3. 37
何首乌乙素 1. 72 3. 30 2. 64
表 3 首乌 9 种有效成分 HPLC 方法学考察回收率试验结果(%)
化合物 平均回收率 ＲSD
大黄素 103. 26 3. 49
大黄素甲醚 103. 43 3. 31
大黄酚 －8 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷 99. 30 2. 99
2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯 －2 － O － β － D －
葡萄吡喃糖苷
98. 10 1. 35
儿茶素 96. 82 2. 95
没食子酸 99. 75 2. 21
没食子酸酯 101. 20 2. 93
苜蓿素 102. 06 2. 67
何首乌乙素 100. 84 3. 33
3. 4 何首乌炮制前后成分的变化
随着炮制时间的延长， 何首乌主要有效成分含量 呈先增加后降低然后趋于稳定的趋势， 多数有效成分 含量炮制到 8 ～10 h 达到最高值。见表 4。

表 4 不同炮制时间对何首乌 9 种有效成分含量的影响(μg/g)

化合物 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 14 h 16 h
大黄素 56. 25 72. 21 78. 19 78. 25 66. 35 53. 75 43. 17 38. 52
大黄素甲醚 30. 21 33. 65 38. 75 35. 11 32. 19 32. 08 30. 52 29. 33
大黄酚
－8 －O －β －D －
葡萄吡喃糖苷
112. 35 135. 05 156. 35 162. 57 225. 75 178. 53 165. 25 159. 78 2， 3， 5， 4' －
四羟基二苯乙烯
－2 －O －β －D －
葡萄吡喃糖苷
1652. 32 1896. 52 1952. 36 2105. 17 2216. 37 1925. 78 1786. 27 1735. 25
儿茶素 38. 96 43. 15 39. 08 37. 18 36. 33 36. 96 35. 98 33. 75
没食子酸 3. 15 4. 02 5. 36 6. 96 7. 25 6. 35 7. 05 7. 85
没食子酸酯 11. 32 12. 35 14. 35 10. 25 10. 12 9. 63 8. 58 8. 62
苜蓿素 12. 35 13. 15 13. 26 12. 96 12. 85 12. 37 12. 22 12. 10
何首乌乙素 16. 35 25. 63 35. 15 40. 58 53. 68 69. 75 85. 15 73. 15

4 讨论

作为一味传统中药材， 现代科学家对对何首乌的 化学成分展开了广泛研究， 目前已知何首乌中分离得 到的主要有效成分包括二苯乙烯类化合物、 蒽醌类化 合物、 黄酮类化合物、 甾醇类化合物和苯丙素类化合物 等 ［4 －5 ］ 。其中大黄素甲醚、 大黄素和大黄酚 －8 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷是主要的蒽醌类化合物;2， 3， 5， 4' － 四羟基二苯乙烯 － 2 － O － β － D － 葡萄吡喃糖苷是 主要二苯乙烯类化合物;儿茶素、 没食子酸、 没食子酸 酯、 苜蓿素和何首乌乙素是主要的黄酮类化合物。本 文精选二苯乙烯类化合物、 蒽醌类化合物、 黄酮类化合 物进行质量控制研究。

早在唐代就有何首乌炮制的明确记载 ， 《理伤续 断方》 记载有“黑豆……同蒸熟” ， 《理伤》 记载有“用 黑豆酒煮七次” 等 ［6 －8 ］ 。2015 版《中华人民共和国药 典》 规定， 何首乌炮制方法可依据炖法、 蒸法或用黑豆 汁匀后蒸。现代研究显示， 生何首乌经炮制后还原糖 含量增多， 其补益作用显著增强;具有具泄下作用的的 结合性蒽醌苷炮制后可水解为游离蒽醌衍生物， 降低 毒性， 从而呈现滋补作用 ［9 －12 ］ 。然而， 由于化合物种类 选择的局限性和测定方法的差异， 适宜的何首乌炮制 时间各文献报道不一， 研究结果存在较大的差异， 药典 中也未作明确规定。

本研究结果显示， 在炮制 2 ～ 8 h 内， 随着炮制时 间的延长， 游离蒽醌的含量逐渐升高;二苯乙烯苷类和 黄酮类成分在 2 ～ 10 h 内含量逐渐升高， 因此确定何 首乌炮制时间为 8 ～ 10 h。任丽建等 ［13 ］ 报道， 在炮制 过程中二苯乙烯苷含量先升后降， 在炮制 6 h 时达到 最大值， 与本文结果一致。而刘振丽等 ［14 ］ 报道称， 何 首乌黑豆汁炖制过程中， 在炮制 32 h 时， 大黄素和大 黄素甲醚含量达到最大值， 结合型蒽醌和含总蒽醌量 均逐渐下。陈艳等 ［15 ］ 研究发现， 加压清蒸炮制何首乌 过程中， 总蒽醌含量基本不变， 炮制 5 h 内游离蒽醌大 黄素和大黄素甲醚含量上升明显， 5 h 后含量逐渐降 低。综上所述， 8 ～ 10 h 为何首乌黑豆汁炖制最佳炮 制时间。

来源：上海中医药杂志 作者：张福君 瞿晶田 王强